EMSA实验详情

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Electrophoretic Mobility Shift Assay--电泳迁移率检测
点击次数：137 发表于：2008-06-18 14:53转载请注明来⾃丁⾹园
来源：互联⽹
凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是⼀种检测蛋⽩质和DNA序列相互结合的技术，最初⽤于研究DNA结合蛋⽩和其相关的DNA结合序列相互作⽤，可⽤于定性和定量分析。

这⼀技术⽬前已⽤于研究RNA结合蛋⽩和特定的RNA序列的相互作⽤，已经成为转录因⼦研究的经典⽅法。

其基本原理是蛋⽩质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物⽐⽆蛋⽩结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。

该⽅法可⽤于检测DNA结合蛋⽩、RNA结合蛋⽩，并可通过加⼊特异性的抗体（supershift）来检测特定的蛋⽩质，并可进⾏未知蛋⽩的鉴定。

⽣物体内DNA转录成RNA是基因表达的关键过程，基因表达调控主要发⽣在转录⽔平。

近年来，基因分⼦⽣物学研究领域的趋势之⼀是逐渐从基因结构和功能分析转到基因顺式作⽤元件和转录因⼦及其转录调控机理上，对基因转录调控的研究将是今后相当长⼀段时期内功能基因组学研究的热点之⼀。

在转录⽔平，基因的转录⾏为是由顺式作⽤元件（cis-acting elements）和反式作⽤因⼦（trans-acting factors）（即转录因⼦）相互作⽤调控的，因此要探讨基因的表达调控规律，分离、鉴定基因的位点控制区（loci control region，LCR）中顺式作⽤元件和相应转录因⼦⾄关重要。

但仅仅如此还不够，对于基因表达调控，必须从三个层次展开：⼀是分离和鉴定基因5＇端核⼼启动⼦等顺式作⽤元件，⼆是分离和鉴定与各顺式作⽤元件相对应的转录因⼦，三是检测各顺式作⽤元件与对应转录因⼦的相互作⽤。

鉴定顺式调控元件和转录因⼦是研究得⽐较多的内容，⽽对于顺式作⽤元件与对应转录因⼦的相互作⽤这个层次的研究相对较为薄弱。

电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是⼀种检测蛋⽩质和DNA序列相互结合的技术，它正是对第三个层次进⾏研究的技术之⼀，核⼼功能是验证蛋⽩质与特定核酸序列的结合特性，从⽽间接推断已知蛋⽩质的靶序列或已知序列的结合蛋⽩分⼦。

我们知道，结构基因组学已经很容易实现⾼通量分析，但在功能研究这个层次上，⽬前还没有真正⾼通量的分析技术出现。

技术的缺乏是后基因组学时代功能研究的主要瓶颈。

和其他功能研究技术⼀样，电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMS A）本⾝也存在诸多缺点，⽐如对于低亲和⼒结合很难进⾏鉴定；难以⽐较不同⽚断之间亲
和⼒⼤⼩的差异；对于蛋⽩复合体与DNA的结合也⽆法鉴定。

由于体外环境和体内环境存在巨⼤的差异，电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）很难真正重建体内蛋⽩质与DNA之间结合过程。

对EMSA进⾏改良或发展更好的研究蛋⽩质与DN A互作的技术很有必要。

简单说明⼀下EMSA技术的优缺点，基本原理和实验⽅法。

Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
Introduction
Advantage：
can separate different types of complexes, such as monomer and dimer => be tter than filter binding
easier to see the complex than footprint assay
Disadvantage: do not know where the binding site is.
Rationale
DNA-protein complex will have a smaller mobility than that of free DNA on nat ive gel
gel electrophoresis and molecular sieve
cage effect - difference between footprint and EMSA
Data interpretation
nonspecific binding
smearing between DNA and complex bands
Methods
Lable DNA
Mix DNA and protein to form complex
Add nonspecific competitor
Separate complex with free probe on a native gel
这⾥只提供了⽅法的基本的路线，具体操作可以参考：
/doc/3abebbffc8d376eeaeaa3188.html /cgi-bin/prot/search.cgi?catid=&query=EMSA&submit 2=Search 下⾯是在⼀个PROTOCAL
1.探针的标记：
（1）如下设置探针标记的反应体系：
待标记探针（1.75pmol/微升）2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X）1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml）1微升
T4 Polynucleotide Kinase （5-10u/微升）1微升
总体积10微升
按照上述反应体系依次加⼊各种试剂，加⼊同位素后，Vortex混匀，再加⼊T4 Poly nucleotide Kinase，混匀。

（2）使⽤⽔浴或PCR仪，37℃反应10分钟。

（3）加⼊1微升探针标记终⽌液，混匀，终⽌探针标记反应。

（4）再加⼊89微升TE，混匀。

此时可以取少量探针⽤于检测标记的效率。

通常标记的效率在30％以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。

为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。

（5）标记好的探针最好⽴即使⽤，最长使⽤时间⼀般不宜超过3天。

标记好的探针可以保存在-20℃。

2. 探针的纯化：
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。

在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。

如需纯化，可以按照如下步骤操作：
（1）对于100微升标记好的探针，加⼊1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加⼊2体积即200微升的⽆⽔⼄醇，混匀。

（2）在-70℃⾄-80℃沉淀1⼩时，或在-20℃沉淀过夜。

（3）在4℃，12,000g-16,000g离⼼30分钟。

⼩⼼去除上清，切不可触及沉。

（4）在4℃，12,000g-16,000g离⼼1分钟。

⼩⼼吸去残余液体。

微晾⼲沉淀，但不宜过分⼲燥。

（5）加⼊100微升TE，完全溶解沉淀。

标记好的探针最好⽴即使⽤，最长使⽤时间⼀般不宜超过3天。

标记好的探针可以保存在-20℃。

3.EMSA 胶的配制：
（1）准备好倒胶的模具。

可以使⽤常规的灌制蛋⽩电泳胶的模具，或其它适当的模具。

最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于⼲胶等后续操作。

为得到更好的结果，可以选择可灌制较⼤EMSA 胶的模具。

（2）按照如下配⽅配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶（注意：使⽤29:1等不同⽐例的Acr/Bis对结果影响不⼤）。

TBE buffer （10X）1毫升
重蒸⽔16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide （40%，w/v）2毫升
80% ⽢油625微升
10% 过硫酸铵（ammonium persulfate）150微升
TEMED 10微升
（3）按照上述次序加⼊各个溶液，加⼊TEMED前先混匀，加⼊TEMED后⽴即混匀，并马上加⼊到制胶的模具中。

避免产⽣⽓泡，并加上梳齿。

如果发现⾮常容易形成⽓泡，可以把⼀块制胶的玻璃板进⾏硅烷化处理。

4.EMSA结合反应：
（1）如下设置EMSA结合反应：
阴性对照反应：
Nuclease-Free Water 7微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升细胞核蛋⽩或纯化的转录因⼦0微升
标记好的探针1微升
总体积10微升
样品反应：
Nuclease-Free Water 5微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升细胞核蛋⽩或纯化的转录因⼦2微升
标记好的探针1微升
总体积10微升
探针冷竞争反应：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升细胞核蛋⽩或纯化的转录因⼦2微升
未标记的探针1微升
标记好的探针1微升
总体积10微升
突变探针的冷竞争反应：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升细胞核蛋⽩或纯化的转录因⼦2微升
未标记的突变探针1微升
标记好的探针1微升
总体积10微升
Super-shift反应：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升细胞核蛋⽩或纯化的转录因⼦2微升
⽬的蛋⽩特异抗体1微升
标记好的探针1微升
总体积10微升
（2）按照上述顺序依次加⼊各种试剂，在加⼊标记好的探针前先混匀，并且室温（2 0-25℃）放置10分钟，从⽽消除可能发⽣的探针和蛋⽩的⾮特异性结合，或者让冷探针优先反应。

然后加⼊标记好的探针，混匀，室温（20-25℃）放置20分钟。

（3）加⼊1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（⽆⾊，10X），混匀后⽴即上样。

注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋⽩和DNA的结合，建议尽量使⽤⽆⾊的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。

如果对于使⽤⽆⾊上样缓冲液在上样时感觉到⽆法上样，可以在⽆⾊上样缓冲液⾥⾯添加极少量的蓝⾊的上样缓冲液，⾄能观察到蓝颜⾊即可。

5.电泳分析：
（1）⽤0.5XTBE作为电泳液。

按照10V/厘⽶的电压预电泳10分钟。

预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加⼊少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液（蓝⾊），以观察电压是否正常进⾏。

（2）把混合了上样缓冲液的样品加⼊到上样孔内。

在多余的某个上样孔内加⼊10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（蓝⾊），⽤于观察电泳进⾏的情况。

（3）按照10V/厘⽶的电压电泳。

确保胶的温度不超过30℃，如果温度升⾼，需要适当降低电压。

电泳⾄EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝⾊染料溴酚蓝⾄胶的下缘1/4处，停⽌电泳。

（4）剪⼀⽚⼤⼩和EMSA胶⼤⼩相近或略⼤的⽐较厚实的滤纸。

⼩⼼取下夹有EMS A胶的胶板，⽤吸⽔纸或普通草纸⼤致擦⼲胶板边缘的电压液。

⼩⼼打开两块胶板中的上⾯⼀块（注：通常选择先移⾛硅烷化的那块玻璃板），把滤纸从EMSA胶的⼀侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。

滤纸被胶微微浸湿后（⼤约不⾜1分钟），轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸⼀起揭起来。

把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上⾯覆盖⼀层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有⽓泡。

（5）⼲胶仪器上⼲燥EMSA胶。

然后⽤X光⽚压⽚检测，或⽤其它适当仪器设备检测。

电泳迁移实验EMSA
点击次数：65 发表于：2008-07-08 17:32转载请注明来⾃丁⾹园
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1 .核蛋⽩的提取
①⽤细胞刮⼦刮取RAW264.7 细胞与VSMC ，移⼊2.5mlEP 管中。

②将细胞⽤冰冷PBS 洗两遍，于4 ℃, 5000g 离⼼3min ，沉淀细胞。

③加5 倍细胞体积的冰浴缓冲液A 洗细胞⼀次，于4 ℃,5000g 离⼼3 min 沉淀细胞. ④加3 倍细胞体积的冰浴缓冲液A 悬浮细胞，冰上放置30min 、剧烈振荡10 次，4 ℃,5000g 离⼼15min ，去上清，沉淀为细胞核。

⑤加与细胞等体积的冰浴缓冲液B ，充分混匀，冰上放置30min 后，于40 ℃,15 000g 离⼼15min, 上清为核蛋⽩。

⑥取2µl 核蛋⽩Bradford 法测定核蛋⽩浓度，分装后于-70 ℃保存。

2. 探针的标记与纯化
A 、探针的标记: 将以下试剂加⼊冰浴中的0.5m l 的EP 管中，总体积20 时。

①未标记的探针:2µl (50ng); ②10 x 激酶缓冲液:2g 1; ③[y-32P]ATP: 4µl (40 uCi); ④T4多聚核⽢酸激酶:lµl (10U); ⑤超纯⽔:11µl 。

B. 混匀后37 ℃⽔浴30 分钟;
C 、加⼊5µl 1%SDS/100 mM EDTA 短暂涡旋混匀，以终⽌激酶反应;
3 .探针的纯化
①准备MicroSpin' G25 分离柱; ②轻轻涡旋分离柱以重悬管内树脂; ③将盖⼦拧松1/4 后去掉管底密封; ④将分离管放⼊⼀只
1.5mlEP 管中(EP 管作⽀撑⽤) ⑤735g 离⼼1分钟; ⑥加⼊样品: ⑦分离管放⼊⼀只新的1.5 mlEP 管中，缓慢将样品加⼊树脂床⾓度平⾯的中央，735g 离⼼1 分钟; ⑧将75µl 超纯⽔加⼊分离柱，735g 离⼼1 分钟; ⑨收集⽀撑管内纯化好的探针，⼩⼼丢弃分离管。

4.测定探针的放射活性
取1µl 纯化的探针，⽤闪烁计数器测量其放射活性，放射活性⼤于1* 10 5cpm/µl ⽰标记成功。

5.凝胶迁移阻滞法测定NF-KB
A 、按下列顺序分别将各反应成分加⼊第⼀套做好标记的EP 管内: ①结合缓冲液: 4µl ②稳定液D:2 µl; ③核提取物:lug; ④去离⼦⽔⾄:16µl.
B 、⽤移液枪轻轻吸打混匀，40℃下将核提取物预孵育20 分钟，
C 、在核提取物预孵育期间，按下列顺序依次将各成分加⼊做好标记的第⼆套EP 管内: ①结合缓冲液:2µl; ②稳定液D:1µl; ③探针:1µl; ④去离⼦⽔:4µl 。

D 、将探针棍合物加⼊预孵育好的核提取物混合物中，⽤移液器轻轻吸打混匀后，4 ℃继续孵育20 分钟。

E、EMSA 测定: 预先将5% ⾮变性丙烯酞胺胶(38:2 ) 和电泳缓冲液(1X TGE) 预冷⾄4 ℃, 然后: ①将每反应管内所有反应物加⼊样品孔中。

同时在⼀空⽩孔中加⼊含溟酚蓝的上样缓冲液，以观测胶的移动情况。

当溟酚蓝电泳⾄玻璃板下1/3 即可停⽌电泳( 约2⼩时) 。

②电泳:12.5V/cm(16cm 玻璃板为200V)。

F 、放射⾃显影: 电泳完毕后，取出凝胶，⽤保鲜膜封好; 将凝胶与放⼊有增感屏的曝光盒中，于-70 ℃放射⾃显影24 ⼩时。

然后将X 光⽚在显影液中显影30sec-1min ，在定影中定影15-30min ，清⽔冲洗⼲净后⾃然晾⼲。

G 、图像分析: 将各测量组的电泳照⽚扫描⾄计算机，然后应⽤Bandscan 分析软件对电泳条带进⾏灰度测定，并计算平均光密度值(OD) ，以各条带的OD 值表⽰相应核转录因⼦的活性。