HIF-1α_纳米抗体的制备及其抑制黑素瘤生长的作用

山西农业科学 2023，51（12）：1435-1441Journal of Shanxi Agricultural Sciences HIF-1α纳米抗体的制备及其抑制黑素瘤生长的作用
李佳敏1，贾琼1，秦蓉芬1，迟志端1，王富明2，范瑞文1
（1.山西农业大学动物医学学院，山西太谷 030801；2.晋中市庄子乡综合便民服务中心，山西晋中 030600）
摘要：缺氧诱导因子1α（Hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）参与低氧微环境相关疾病的发生等过程，具有控
制肿瘤生长和发展的功能。

黑色素瘤是一种发生于人和动物恶性程度较高的肿瘤。

为探明HIF-1α纳米抗体对
黑色素瘤的影响，研究利用前期保存的羊驼源黑色素瘤细胞噬菌体文库筛选HIF-1α纳米抗体，经原核表达与纯
化后，通过Western Blot和免疫组织化学验证HIF-1α纳米抗体与抗原的结合性；分别通过CCK-8法、划痕试验
以及Western Blot法检测其对B16黑素瘤细胞的增殖和迁移能力及其相关分子表达的影响。

结果表明，经表达
和纯化获得的HIF-1α纳米抗体分子质量约为16 ku，没有跨膜结构，具有亲水性。

通过Western Blot和免疫组织
化学验证了其具有良好的抗原结合性。

在增殖试验和划痕试验中，与对照组相比，HIF-1α纳米抗体抑制了B16
细胞的增殖和迁移，下调了靶基因VEGF的表达，并使细胞增殖和迁移相关蛋白Ras、ERK、RAC和RAF的表达
量下调。

预测HIF-1α纳米抗体进入B16细胞内，与抗原结合，通过下游靶基因VEGF下调RAs、ERK、RAC、RAF的表达，从而对细胞增殖和迁移起抑制作用，可作为黑色素瘤治疗的新靶点。

关键词：HIF-1α；纳米抗体；B16细胞；Western Blot法；CCK-8法；细胞增殖；细胞迁移
中图分类号：R739.5　文献标识码：A 文章编号：1002‒2481（2023）12‒1435‒07
Effect on Preparation of HIF-1α Nano-Antibody and Its
Inhibition of Melanoma Growth
LI Jiamin1，JIA Qiong1，QIN Rongfen1，CHI Zhiduan1，WANG Fuming2，FAN Ruiwen1
（1.College of Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；
2.Jinzhong City Zhuangzi Integrated Convenient Service Center，Jinzhong 030600，China）
Abstract：The hypoxia inducible factor 1α(HIF-1α) is involved in the occurrence of diseases related to hypoxia microenvironment and has the function of controlling tumor growth and development. As we known, melanoma is a highly malignant tumor occurring in animals and humans. To explore the effect of HIF-1α nano-antibody on melanoma, in this study, the phage library of alpaca-drived melanoma cells previously preserved in our laboratory was used to screen HIF-1α nano-antibodies. After prokaryotic expression and purification, the binding of HIF-1α nano-antibody and its antigen was verified by Western blot and immunohistochemistry. The effects of HIF-1α nano-antibody on the proliferation and migration of B16 melanoma cells and the expression of related molecules were detected by CCK-8, wound healing test, and Western blot methods. The results showed that HIF-1α nano-antibody obtained by expression and purification was hydrophilic protein without transmembrane structure and had a molecular weight of about 16 ku. Western blot and immunohistochemistry results showed that it had good antigenic binding. In the proliferation and wound healing experiments, HIF-1α nano-antibody inhibited the proliferation and migration of B16 cells, down-regulated the expression of target gene VEGF and the proliferation and migration related proteins Ras, ERK, RAC, and RAF, comparing with the control group. In Conclusion, it was predicted that HIF-1α nano-antibody entered B16 cells and combined with antigens and down-regulated the expression of RAs, ERK, RAC, RAF through the downstream target gene VEGF, which inhibited cell proliferation and migration, and could be used as a new target for melanoma treatment.
Key words：HIF-1α; nano-antibody; B16 cells; Western Blot method; CCK-8 method; cell proliferation; cell migration
氧是生命活动中所必需的物质，且在其中起重要作用[1]。

缺氧在恶性肿瘤中是较为常见的，且缺氧还是肿瘤生长环境最显著的特征之一[2]。

组织和细胞是通过缺氧诱导因子（Hypoxia inducible factor，
doi
doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.12.12
收稿日期：2023-02-06
基金项目：“三晋学者”支持计划专项经费
作者简介：李佳敏（1996-），女，山西阳泉人，在读硕士，研究方向：动物细胞分子调控与生物工程。

通信作者：范瑞文（1974-），女，山西偏关人，教授，博士，主要从事动物细胞分子调控与生物工程研究工作。

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HIF）诱导相应靶基因来适应氧气浓度[3]。

HIF-1、HIF-2及HIF-3是HIF的3种亚型，均由氧调节型α亚基和组成型β亚基构成，α亚基是活性亚基，又分为HIF-1α，HIF-2α和HIF-3α[4]。

HIF-1α与氧浓度的关系密切，HIF-1α是缺氧细胞基因表达的关键，其稳定性和活性受各种翻译后修饰、羟基化、乙酰化和磷酸化的调节[5]。

HIF-1α成为许多适应低氧微环境疾病的主要参与者，如癌症、中风和心脏病[6]。

因此，阻断HIF-1α的表达或阻断其相互作用的蛋白质会抑制肿瘤生长[7]。

HIF-1α在肿瘤组织中表达增高，一方面与肿瘤组织增生过快造成局部组织缺氧有关，另一方面，HIF-1α是多种依赖氧张力的调节因子[8]，与某些癌基因激活或抑癌基因失活有关。

因此，HIF-1α的表达量可作为检测恶性肿瘤的标准。

黑色素瘤来源于黑色素细胞，是一种具有侵袭性的皮肤癌[9-10]。

黑色素瘤虽然发病率不高，但其死亡率较高[11-12]。

黑色素瘤多发于哺乳动物皮肤和黏膜，均具有侵袭性和致死性，且预后差[13-14]。

HIF-1α的表达与肿瘤的发生发展有关，研究其在黑色素瘤发病和发展机制中的作用对于改善患者的临床结果至关重要[15]。

HIF-1α介导不同过程的基因转录，包括应激适应、代谢、凋亡、肿瘤生长、血管生成和侵袭[16]。

近年来研究还发现，HIF-1α参与了PI3K/Akt/mTOR、Ras/RAF/MEK/ERK、JAK/ STAT、Wnt/β-catenin、Notch等信号通路[17-18]，这些路径及其相关的复杂变化影响黑色素瘤的生长和发展、新陈代谢、运动和细胞凋亡[19]。

传统抗体药物分子较大，结构复杂，较易失活且价格昂贵。

纳米抗体的优势在于分子小、渗透性强，能够针对传统单抗所不能触及的抗原表位设计药物，使其更好地到达肿瘤内部以及穿透血脑屏障[20]。

因此，基于HIF-1α表达受到抑制将发挥抗肿瘤功能，结合纳米抗体的优势，本研究以羊驼源黑色素瘤B16噬菌体文库制备HIF-1α纳米抗体，并验证其在黑素瘤的生长和发展过程中的作用，旨在为抑制肿瘤生长提供新思路。

1　材料和方法
1.1　试验材料
大肠杆菌TG1、辅助噬菌体M13K07、B16细胞和羊驼源黑色素瘤B16噬菌体文库、正常小鼠脑组织切片均由山西农业大学羊驼生物工程实验室保存提供。

HIF-1α多肽购自武汉三鹰生物科技有限公司。

1.2　试验方法
1.2.1　HIF-1α纳米抗体的筛选　将HIF-1α多肽稀释至终质量浓度为20 μg/mL，包被免疫管，4 ℃静置过夜，以备用。

将TG1接种于5 mL 2YT培养基中，37 ℃、200 r/min过夜振荡培养以活化。

将500 μL噬菌体文库溶于100 mL 2YT/AG 溶液培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养至D600nm 值为0.4~0.6；加入100 μL辅助噬菌体，混匀静置30 min，再37 ℃、200 r/min振荡30 min，弃上清，加入100 mL 2YT/AK液体培养基重悬沉淀，30 ℃、200 r/min振荡培养至过夜。

次日，将TG1接入30 mL 2YT中，37 ℃、200 r/min培养至D600nm=0.4备用。

4 ℃、11 000 r/min离心10 min，去上清加入1/5体积遇冷的PEG/NaCl，冰上放置70 min。

离心后用2.4 mL无菌PBS重新悬浮菌体沉淀，再次离心，回收上清加入事先包被20 μL/mLHIF-1α多肽的免疫包被管中。

37 ℃封闭1 h后用PBS冲洗，并加入三乙醇胺，缓慢振荡15 min，加入Tris-HCl 中和。

将其涂布于2YT/AG平板，30 ℃培养过夜。

次日收集菌落，作为HIF-1α一级文库。

按上述方法，分别以10、5、2.5 μg/mL的HIF-1α质量浓度进行第2轮、3轮、4轮的淘筛。

从第4轮筛选洗脱物滴定的平板上，随机挑取96个单克隆接种于2YTAG中与30 ℃振荡培养8 h，加入稀释的噬菌体，37 ℃振荡培养1 h后离心，弃去上清用含有Kana抗性的培养基重悬沉淀，37 ℃过夜培养。

将HIF-1α蛋白和BSA蛋白包被于96孔板，用ELISA法筛选阳性克隆并进行测序，比对测序结果，在NCBI基因库中选择VHH序列并用DNAMAN 进行比对和ORF Finder软件进行氨基酸序列分析，选取能够完整表达蛋白质的菌株，进行后续试验。

1.2.2　载体的构建　按阳性克隆的DNA序列设计引物（含Bam HI、Sal I酶切位点）：HIF-1α-F：5'-CGGGATCCGAGTCGGGAGGAGGCTTGG-3'；HIF-1α-R：5'-GCGTCGACTGAGGAGACGGT GACTAGGG-3'。

PCR扩增反应体系为50 μL：2×Es Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板5 μL，ddH2O 补至50 μL。

PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；
95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳胶回收，
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将回收产物和PMD19-T连接，PMD-19T反应体系为：PMD-19T 1 μL，回收产物4 μL，Solution Buffer 1 μL。

之后再以Bam HI、Sal I将19TNbHIF-1α和pET-28a进行双酶切并进行T4连接（双酶切体系为：10×QuickCut Buffer 5 μL，Bam HⅠ 1 μL，SalⅠ 1 μL，19TNbHIF-1α质粒8 μL，ddH2O 35 μL；T4连接体系为：回收菌体质粒6 μL，回收载体2 μL，T4连接酶1 μL，T4Buffer 2 μL，ddH2O 9 μL，将连接产物转化至E.coli DH5α，涂布于含100 μg/mL Kana的LB平板上37 ℃培养过夜，挑取单克隆接种于LB-Kana液体培养基摇至D600为0.4~0.6后测序，将测序结果正确的质粒命名为pET28a-NbHIF-1α。

1.2.3　HIF-1α纳米抗体表达与纯化　将5 μL pET28a-NbHIF-1α提取质粒，将该质粒转入BL21（DE3）中，冰浴30 min，42 ℃热激45 s，再冰浴3 min，37 ℃、200 r/min振荡活化1 h，菌液接种于LB-Kana液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡至D600为0.6，加入0.3 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），28 ℃、200 r/min摇菌4 h后收菌，将菌液沉淀用PBS清洗2次后超声破碎，16 000 g离心30 min。

使用AKTA层析系统与镍离子金属螯合亲和层析介质（Ni-NTA）预装柱对带有His标签的纳米抗体进行纯化，分别用不同梯度咪唑和分子筛除去杂蛋白，将蛋白用超滤管浓缩后分装，-80 ℃保存。

1.2.4　HIF-1α纳米抗体的应用　将6周龄正常小鼠脑组织研磨后提取总蛋白后进行SDS-PAGE电泳，将纯化的HIF-1α纳米抗体作为一抗、HRP-His-Tag作为二抗进行Western Blot检测脑组织中HIF-1α蛋白的表达。

将制备的小鼠脑组织制备石蜡切片经脱蜡、抗原修复，然后在3%双氧水中室温孵育30 min。

用PBS洗涤后，用5%BSA在37 ℃封闭1 h，然后与纯化的纳米抗体或PBS（空白对照）孵育，之后于37 ℃在His-tag抗体孵育1 h。

DAB显色，随时观察停止显色，然后用苏木精复染，脱色封片，检测小
鼠脑组织中HIF-1α表达分布。

1.2.5　HIF-1α纳米抗体对黑素瘤细胞增殖的影响待B16细胞在培养皿中长到80%~90%，与HIF-1α纳米抗体加入96孔板中，并保证每孔2 000个，37 ℃、5%CO2培养箱中待6 h后，在每孔中加入10 μL CCK-8 工作液，检测0、3、6、9 h的450 nm波长的吸光度。

1.2.6　HIF-1α纳米抗体对黑素瘤细胞迁移的影响　将培养到80%~90%的B16细胞传代至12孔板中，待细胞长满12孔板后，使用直尺与100 μL枪头在12孔板划平行线，用PBS缓冲液洗净残留细胞。

试验组加入HIF-1α纳米抗体。

分别在划痕0、12、24、36 h后对同一位置进行拍照，观察细胞迁移结果。

1.2.7　HIF-1α纳米抗体对增值相关蛋白表达的影响　选取培养状态良好且培养到80%~90%的丰度，细胞传代到6孔板中，试验组和对照组各3个孔。

试验组中加入HIF-1α抗体，放入培养箱中进行过夜培养。

培养至对数生长期，收集细胞，提取细胞总蛋白。

用所提蛋白进行Westen Blot检测，以β-actin为内参，检测细胞中Ras、RAF1、ERK1/2、RAC1和VEGF蛋白表达量。

2　结果与分析
2.1　HIF-1α纳米抗体的筛选及序列特征
通过对阳性克隆的序列进行比对，筛选出6个VHH序列。

经过ELISA法对6个阳性克隆进行抗原结合力检测，选取1A12作为候选克隆（表1）。

1A12的核苷酸序列与NCBI数据库中的VHH序列相似性达到78%（图1-A），通过对1A12克隆的氨基酸序列分析，发现该序列没有形成跨膜区（图1-B），为亲水性蛋白（图1-C）。

1A12的氨基酸序列由88个氨基酸构成，含有完整的4个框架区（FR1~FR4）和3个高度可变抗原结合区即互补决定区（CDR1~CDR3），其中CDR3是抗原特异性识别的区域，含有11个氨基酸（图1-D）。

表1 HIF-1α单克隆ELISA筛选结果Tab.1 Monoclonal screening of HIF-1α by ELISA
阳性克隆编号Positive clone num⁃
ber
1A12
1A6
1E6
试验组OD值
OD value of experimen⁃
tal group
0.918
0.901
0.509
阴性对照OD值
OD value of negative
control
0.039
0.040
0.101
阳性克隆编号
Positive clone num⁃
ber
2E1
2D2
1A8
试验组OD值
OD value of experimen⁃
tal group
0.878
0.692
0.768
阴性对照OD值
OD value of negative
control
0.040
0.044
0.151
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2.2　纳米抗体表达、纯化与结合性检测
以挑选出的VHH （1A12）序列质粒为模板进行PCR ，扩增出大小约为400 bp 的VHH 片段（图
2-A ）。

将VHH 片段与PMD19-T 连接后再连接到pET -28a 表达载体上以构建质粒（图2-B ）。

构建的质粒经原核表达和纯化后，用考马斯亮蓝染色以及Western Blot 进行鉴定，结果发现，考马斯亮蓝染色得到的条带较单一（图3-A ）；Western Blot 检测发现大小约为16 ku 的特异性条带（图3-B ），说明该蛋白为表达所得的特异蛋白。

选取小鼠脑组织，免疫组织化学一抗试验组用HIF -1α纳米抗体，用PBS 作对照，可看出大脑组织中的免疫阳性信号（图3-C ），由此可见，HIF -1α纳米抗体可以与抗原HIF -1α结合，用于HIF -1α的组织定位。

Western Blot 试验中一抗用纯化所得的HIF -1α纳米抗体，选取小鼠脑组织提取蛋白，结果显示，HIF -1α纳米抗体作为一抗可以与抗原HIF -1α结合，检测到特异性的免疫阳性条带，分子质量约为100、120、130 ku （图3-D ），说明脑组织中表达HIF -1α。

由此可知，制备的HIF -1α纳米抗体可用于Western Blot 试验的一抗以检测组织中HIF -1α抗
原表达的相对定量。

A.VHH 片段的PCR 扩增（M 为500DNA 相对分子质量标准；1、2、3、4、5为VHH 的PCR 扩增结果）；
B.质粒双酶切（M1为2000DNA 相对分子质量标准；1、2、3、4、5为以Bam HⅠ和Sal Ⅰ为酶切位点切开19TNb HIF -1α）；
C. 载体双酶切（M2为15 000 DNA 相对分子质量标准；6为未切pET -28a ；7、8、9、10、11为以Bam HⅠ和Sal Ⅰ为酶切位点切开pET -28a ）
A. PCR products of VHH fragment(M was 500 DNA ladder; 1, 2, 3, 4, 5 were the PCR products of VHH);
B. Plasmid double enzyme cleavage(M1 was DNA 2000 ladder; 1, 2, 3, 4, 5 were fragments of 19T -NbHIF -1α cut by BamHⅠ and Sal I ). C . Carrier double enzyme cleavage(M2 was DNA 15000 ladder; 6 was original plasmid of pET -28a; 7, 8, 9, 10, 11 were fragments of pET -28a cut by Bam HⅠ and Sal Ⅰ)
图2　质粒的构建
Fig.2　
Construction of the plasmid
A.1A12的DNA 序列比对结果；
B.序列跨膜区分析；
C.序列亲水性分析；
D.序列的框架结构
A. Alignment of 1A12 DNA sequence;
B. The transmembrane region analysis of the sequence;
C. The hydrophilicity analysis of the sequence;
D. The frames of the sequence
图1　HIF-1α纳米抗体（1A12）的序列特征
Fig.1　Sequence characteristics of HIF-1α nano-antibody （1A12）
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李佳敏等：HIF -1α纳米抗体的制备及其抑制黑素瘤生长的作用
2.3　HIF-1α纳米抗体对黑色素瘤细胞增殖、迁移及其相关蛋白表达的影响
将HIF -1α纳米抗体加入B16细胞培养基中，用CCK -8法检测并观察对B16细胞增殖的影响，结果显示，在HIF -1α纳米抗体作用下，在3~9 h 内，
加入HIF -1α纳米抗体的B16细胞表现出了抑制效果（图4-A ）。

将HIF -1α纳米抗体加入B16细胞培养基中，用细胞划痕试验检测HIF -1α纳米抗体对B16细胞迁移的影响。

B16细胞在培养0、12、24、36 h 检测，在12 h 时已出现抑制细胞迁移现象（图4-B ）。

A.HIF -1α纳米抗体的纯化结果（M.蛋白质相对分子质量标准；1~9为纯化后蛋白）；
B. Western Blot 检测HIF -1α纳米抗体的His 标签；
C.免疫
组化检测小鼠脑组织HIF -1α纳米抗体与抗原的结合性（20×）；D. Western Blot 检测HIF -1α纳米抗体与抗原的结合性
A. Purification of HIF -1α nano -antibody(M was standard molecular weight of protein mass; 1-9 were purified proteins);
B. Western blot result for testing HIF -1α nano -antibody with His -tag;
C. Immunohistochemical results of HIF -1α binding with antigen in mice brain;
D. Western blot results of HIF -1α binding with antigen
图3　HIF-1α纳米抗体的纯化及结合性检测
Fig.3　Detection of purification and binding of HIF-1α
nano-antibody
A.HIF -1α纳米抗体对B16细胞增殖的影响；
B.HIF -1α纳米抗体对B16细胞迁移的影响（40×）；C 、D.HIF -1α纳米抗体对B16细胞中增殖相关蛋白表达的影响。

*.P <0.05，**.P <0.01，***.P <0.001，****.P <0.000 1
A. Effects of HIF -1α nano -antibody on the proliferation of B16 cells;
B. Effects of HIF -1α nano -antibody on the migration of B16 cells; C, D. Effects of HIF -1α nano -antibody on the expression of proliferation -related proteins in B16 cells, *. P < 0.05， **. P < 0.01， ***. P < 0.001， ****. P < 0.000 1
图4　HIF-1α纳米抗体对B16细胞增殖、迁移及其相关蛋白表达的影响
Fig.4　Effects of HIF-1α nano-antibody on proliferation ，migration ，and expression of the related proteins in B16 cells
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在CCK-8法检测HIF-1α纳米抗体抑制B16细胞增殖的基础上，提取HIF-1α纳米抗体处理15 h 后的B16细胞总蛋白，用Western Blot检测VEGF、RAS、ERK、RAC和RAF蛋白的表达量，与对照组相比，HIF-1α纳米抗体处理B16细胞后其蛋白量均呈下降趋势（图4-C、D）。

3　结论与讨论
HIF-1α亚基是碱性-环-螺旋（basic-helix-loop-helix, Bhlh）–PAS（per/ARNT/Sim，PAS）)超家族成员之一[21]，HIF-1α位于多种致癌和抑癌途径的交汇点，包括PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路，而这些信号通路是分子信号网络的核心，控制着许多细胞的生长、增殖、分化和生存，而肿瘤组织常高表达HIF-1α[22-23]。

通过多种方式抑制HIF-1α的表达有望成为治疗黑色素瘤的方法。

本研究通过已建立的羊驼源黑素瘤噬菌体文库，以HIF-1α多肽进行4轮淘筛，筛选出1株阳性单克隆菌株，经过原核表达载体构建并诱导表达目的蛋白，镍柱纯化得到HIF-1α纳米抗体。

所得的纳米抗体抗原特异性识别区域CDR3含有11个氨基酸残基超过了传统抗体CDR3的平均长度（7~9个氨基酸残基），可增大与抗原的接触面积，因此其与抗原具有较好的亲和性。

VEGF家族是一类血管调节因子[24]，新生血管生成是肿瘤转移的潜在机制之一，血管参与加速肿瘤生长、促进肿瘤转移等过程[25]。

在黑素瘤细胞中，HIF-1α纳米抗体穿过细胞膜进入胞质中，与HIF-1α结合后，抑制VEGF下游靶基因表达，并抑制Ras信号路径中关键基因的表达，同时使黑素瘤细胞中ERK和P-ERK表达下调，ERK是丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成员之一，该酶被激活后，成为磷酸化的ERK（P-ERK）。

p-ERK可以介导信号由胞浆向胞核传递，参与调节细胞的生长、发育、分化、分裂等多种生理过程，其异常表达在细胞的恶性转化和肿瘤的发生发展中起重要作用[26]。

并且发现HIF-1α纳米抗体在黑素瘤细胞中引起RAF1表达下调，通过PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK信号通路使细胞增殖和迁移速度下降[27]。

此外，在肿瘤组织中，由于新生血管管壁仅有1层内皮细胞，缺乏基底膜，内皮细胞间常有裂隙，同时VEGF本身可提高血管通透性，并刺激内皮细胞释放胶原酶使肿瘤细胞与肿瘤组织分离脱落，为肿瘤的转移创造了条件[28]。

因此，HIF-1α纳米抗体在
黑素瘤组织中可能会通过抑制血管形成而成为抑制肿瘤生长和发展的新材料。

本研究获得的HIF-1α纳米抗体分子质量约为16 ku，没有跨膜结构，具有亲水性。

HIF-1α纳米抗体在构建原核表达载体时加入了His标签，将HIF-1α纳米抗体作为Western Blot和免疫组织化学技术中的一抗，与组织细胞中的HIF-1α特异性结合，使用HRP-His-tag抗体作为二抗，来检测HIF-1α在组织中的含量及分布。

将自备的HIF-1α纳米抗体作用于B16细胞时，HIF-1α纳米抗体与HIF-1α结合，直接影响下游靶基因VEGF，并引发该信号通路的下调，抑制B16细胞的增殖和迁移，揭示其可能在黑色素瘤增殖、侵袭和转移中发挥着较为重要的作用，可作为基因治疗黑色素瘤的靶点。

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