LC MS方法鉴定黄酮类化合物
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黄酮骨架上结合位点的不同可能与其酶抑制活性 抗氧化活性有关 在Manach 的研究 中;大剂量 Quercetin 给以大鼠后;其甲基化代谢产物 Isorhamnetin 含量很高 而已知 Isorhamnetin对黄嘌呤氧化酶 的抑制能力强于Quercetin
黄酮类化合物的MS鉴定
电轰击Electron impact;EI质谱法
糖 Glucose is the most commonly sugar
Galactose; rhamnose; xylose and arabinose are not uncommon
Mannose; fructose; glucuronic and galacturonic acids are rare
1 对心血管系统的作用 芦丁 橙皮苷 降低血管脆性及异常通透性； 芦丁 槲皮素 有明显扩冠作用等
2 抗肝脏毒作用 水飞蓟素等治疗急 慢性肝炎;肝硬化;中毒性肝损伤等疾病
3 抗炎作用 4 雌激素样作用
HO
O
HO
大豆素
O OH
5 抗菌 抗病毒作用
6 致泻作用
7 解痉作用
OH
己烯雌酚
机理：抗氧化活性
黄酮C环取代情况对DPPH自由基清除能力影响显著;B环上的相邻羟基 对抗氧化也有影响
四 黄酮化合物的生物功能 1 使植物免除紫外线对植物的辐射损伤； 2 抵抗昆虫 病原菌； 3 络合有毒金属离子； 4 参与光敏过程与能量转移； 5 调节植物生长等生理活动等
同种不同属植物的化学何成分有一定相似性;故在植物 化学分类学上作为Chemotaxonomic markers
五 黄酮的生物活性
Stobiecki; M ; et al ; Profiling of phenolic glycosidic conjugates in leaves of Arabidopsis thaliana using LC/MS Metabolomics; 2006 24: p 197219
CID mass spectra of kaempferol 3Oglucosylglucoside 7Orhamnoside; MW 756
287 433
Positive mode
595 757
Product ion from M+H+ ions – cone voltage 20 V and collision energy: 10; 15; 20 and 25 eV; registered with triple quadrupole analyzer
The CID spectra of M+H+ions the firstsugar or saccharide residue to be eliminated originatesfrom the C3 position This regiospecific process occurs in all 3;7 – O glycosilated flavonols examined
黄酮类化合物的质谱MS鉴定
黄酮类化合物 flavonoids
一 概述
广泛分布于植物中的天然有氧杂环化合物;主要游离态和与糖结合成苷的形式存在 藻类 细菌等微生物中没有发现黄酮类化合物的存在
以前;黄酮类化合物主要是指基本母核2苯基色原酮类化合物;现在则是泛指两个苯环 A与B环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物
对黄酮苷首先对样品进行甲基化 乙基化 三甲基硅烷化等衍生化操作
化学电离Chemical ionization;CI质谱法
对黄酮苷的鉴定效果差
场解析Field desorption;FD质谱法
快原子轰击Fast atom bombardment;FAB质谱法
LCMS法鉴定黄酮
热喷雾Thermospray ionization;TSP 质谱
O
O
色原酮
O
O 2苯基色原酮
B O AC
C6C3C6
二 黄酮的分类
根据 C 环三碳的氧化程度对黄酮进行分类：
O
O
Flavones
O
OH O
Flavonols
O
O
Flavanones
O
OH O
Flavanonols
O
O
Chalcones
O
O
Isoflavanones
O OH
Flavan3diols
O
6´´Omalonate
18 B trifoside 22 irilone 4´O Dglucoside
6´´Omalonate
27 trifoside 6´´Omalonate
MalonateFree Sample of flower
13 A 3methylquercetin 7O Dglucoside 14 irilone 4´O Dglucoside 18 trifoside
20 flavonoid glycoside malonates黄酮丙二酸葡萄糖苷were detected in the flower extract
This is the first detection of the six malonates in the extracts of red clover; and among them; three are new compounds
O
Isoflavones
O
OH O
Flavan3; 4diols
O C H
O
Aurones
三 黄酮的生物合成
3 mol 丙二酰辅酶A与1 mol 桂皮酰辅酶A合成
R1 R2
7
R3
5
R4
R7
R 6 2’
R8 4’
O 2 6’ R 9 3 R10
4 R5
O
R取代基：H OH OCH3 以及糖类等
众多的取代位点 取代基团的存在使得黄酮类化合物成为一类种类繁多的化合物
CID MS/MS spectra of kaempferol 3Orhamnosylglucosylglucoside 7Orhamnoside; MW 902
Negative mode 287 433
595 755
901 首次发现的新化合物
质谱规律总结：
Positive spectra of kaempferol 3Oglucoside 7Orhamnoside and Isorhamnetin 3Oglucoside 7Orhamnoside the rupture of glucose from the C3 hydroxyl was noted in the first step of fragmentation
HPLC profile for 28 different polyphenols on a C18 column
Lin; L Z ; et al ; LCESIMS study of the flavonoid glycoside malonates of red clover Trifolium pratense J Agric Food Chem; 2000 482: p 35465 红三叶草
CID MS/MS spectra of kaempferol 3Orhamnosylglucosylglucoside 7Orhamnoside; MW 902
493
Positive mode
779 925
M+Na+ ions – cone voltage 25 V and collision energy 20 or 25 eV; registered with triple quadrupole analyzer
CID mass spectra of kaempferol 3Oglucosylglucoside 7Orhamnoside; MW 756
Negative mode 609
285
431
755
Product ion from MH ions – cone voltage 25 V and collision energy: 15; 20; 25 and 30 eV; registered with triple quadrupole analyzer
1 LCTSPMS重现性较差;受溶剂成分 取样杆温度及离子源温度的影响； 2 软电离技术;在谱图中只有分子离子峰;碎片非常少； 3 对分析物要求有一定的极性;流动相中要有一定量的水;对热稳定性差的化合物 有明显的分解作用
ESI 是LCMS 最常用的方法离子源
LCMS很少被用于对化合物的完全指认;而LCMS/MS用于结构鉴定 结果更可靠
Lin; L Z ; et al ; Chromatographic profiles and identification of new phenolic components of Ginkgo biloba leaves and selected products J Agric Food Chem; 2008 5615: p 66719
1974年;1674种 1980年;2721种 1993年;超过4000种 2010年;
羟基理论上都是成苷位点;但某些位点羟基更易于成苷：
7 羟基 in flavones; flavanones 与isoflavones 3; 7 羟基 in flavanols and flavanols 3; 5 羟基 in anthocyanidins 6; 8 位易连接碳苷 4位有氧原子时;5位羟基极少成苷
六 黄酮在人体内吸收 分布 代谢 排泄ADME
天然黄酮多以糖苷的形式存在;黄酮的存在形式与其吸收有密切关系 Hollman 认为槲皮素以糖苷形式较苷元吸收好;但有人持不同意见
黄酮在小肠细胞内与葡萄糖醛酸结合;然后与蛋白结合并被转运到肝脏;在肝脏中进一 步结合上硫酸盐或和甲基;从而在循环系统中有较长消除时间;半衰期达到2228h
方 法 要 点： 1 大量的标准品； 2 正 负离子模式结合； 3 离子化过程的高 低两种电压； 4 样品加酸水解;黄酮苷发生水解反应； 5 样品热处理;丙二酸酯键裂解； 6 借助文献紫外数据等
缺点 1 大量的对照品； 2 仍有一些黄酮无法鉴定
USDA Database for the Flavonoid Content of Selected Foods – 2003
黄酮化合物对ESI负离子模式更敏感;但提供的结构信息较少;而正离 子模式提供更多结构信息;两种模式结合下有利于黄酮鉴定
在0 5%甲酸做流动相改性剂可达到正离子模式下的最低检测限制;也有 人认为乙酸较甲酸能提高离子化效率
色谱保留时间也提供一些结构信息;黄酮甲基化 糖苷化种类 位点 数量影响其极性 黄酮苷较其苷元先被洗脱出；二糖苷较单糖苷先被洗脱出； 甲基化黄酮在色谱中保留时间较长
The fragmentation of the MH ions proceeds differently starting with a preferential loss of the sugar unit at C7
Davis; B D and J S Brodbelt; Determination of the glycosylation site of flavonoid monoglucosides by metal complexation and tandem mass spectrometry Journal of the American Society for Mass Spectrometry; 2004 159: p 12871299
2Hale Waihona Puke 个标准品LCMS分析MalonateFree Samples Preparation for LCMS Study
Direct extract of flower
11 A 3methylquercetin 7O Dglucoside 12 B irilone 4´O Dglucoside 16 3methylquercetin 7O Dglucoside
DAD数据同样提供结构黄酮类别信息
Sakakibara; H ; et al ; Simultaneous determination of all polyphenols in vegetables; fruits; and teas Journal of Agricultural and Food Chemistry; 2003 513: p 571581
黄酮类化合物的MS鉴定
电轰击Electron impact;EI质谱法
糖 Glucose is the most commonly sugar
Galactose; rhamnose; xylose and arabinose are not uncommon
Mannose; fructose; glucuronic and galacturonic acids are rare
1 对心血管系统的作用 芦丁 橙皮苷 降低血管脆性及异常通透性； 芦丁 槲皮素 有明显扩冠作用等
2 抗肝脏毒作用 水飞蓟素等治疗急 慢性肝炎;肝硬化;中毒性肝损伤等疾病
3 抗炎作用 4 雌激素样作用
HO
O
HO
大豆素
O OH
5 抗菌 抗病毒作用
6 致泻作用
7 解痉作用
OH
己烯雌酚
机理：抗氧化活性
黄酮C环取代情况对DPPH自由基清除能力影响显著;B环上的相邻羟基 对抗氧化也有影响
四 黄酮化合物的生物功能 1 使植物免除紫外线对植物的辐射损伤； 2 抵抗昆虫 病原菌； 3 络合有毒金属离子； 4 参与光敏过程与能量转移； 5 调节植物生长等生理活动等
同种不同属植物的化学何成分有一定相似性;故在植物 化学分类学上作为Chemotaxonomic markers
五 黄酮的生物活性
Stobiecki; M ; et al ; Profiling of phenolic glycosidic conjugates in leaves of Arabidopsis thaliana using LC/MS Metabolomics; 2006 24: p 197219
CID mass spectra of kaempferol 3Oglucosylglucoside 7Orhamnoside; MW 756
287 433
Positive mode
595 757
Product ion from M+H+ ions – cone voltage 20 V and collision energy: 10; 15; 20 and 25 eV; registered with triple quadrupole analyzer
The CID spectra of M+H+ions the firstsugar or saccharide residue to be eliminated originatesfrom the C3 position This regiospecific process occurs in all 3;7 – O glycosilated flavonols examined
黄酮类化合物的质谱MS鉴定
黄酮类化合物 flavonoids
一 概述
广泛分布于植物中的天然有氧杂环化合物;主要游离态和与糖结合成苷的形式存在 藻类 细菌等微生物中没有发现黄酮类化合物的存在
以前;黄酮类化合物主要是指基本母核2苯基色原酮类化合物;现在则是泛指两个苯环 A与B环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物
对黄酮苷首先对样品进行甲基化 乙基化 三甲基硅烷化等衍生化操作
化学电离Chemical ionization;CI质谱法
对黄酮苷的鉴定效果差
场解析Field desorption;FD质谱法
快原子轰击Fast atom bombardment;FAB质谱法
LCMS法鉴定黄酮
热喷雾Thermospray ionization;TSP 质谱
O
O
色原酮
O
O 2苯基色原酮
B O AC
C6C3C6
二 黄酮的分类
根据 C 环三碳的氧化程度对黄酮进行分类：
O
O
Flavones
O
OH O
Flavonols
O
O
Flavanones
O
OH O
Flavanonols
O
O
Chalcones
O
O
Isoflavanones
O OH
Flavan3diols
O
6´´Omalonate
18 B trifoside 22 irilone 4´O Dglucoside
6´´Omalonate
27 trifoside 6´´Omalonate
MalonateFree Sample of flower
13 A 3methylquercetin 7O Dglucoside 14 irilone 4´O Dglucoside 18 trifoside
20 flavonoid glycoside malonates黄酮丙二酸葡萄糖苷were detected in the flower extract
This is the first detection of the six malonates in the extracts of red clover; and among them; three are new compounds
O
Isoflavones
O
OH O
Flavan3; 4diols
O C H
O
Aurones
三 黄酮的生物合成
3 mol 丙二酰辅酶A与1 mol 桂皮酰辅酶A合成
R1 R2
7
R3
5
R4
R7
R 6 2’
R8 4’
O 2 6’ R 9 3 R10
4 R5
O
R取代基：H OH OCH3 以及糖类等
众多的取代位点 取代基团的存在使得黄酮类化合物成为一类种类繁多的化合物
CID MS/MS spectra of kaempferol 3Orhamnosylglucosylglucoside 7Orhamnoside; MW 902
Negative mode 287 433
595 755
901 首次发现的新化合物
质谱规律总结：
Positive spectra of kaempferol 3Oglucoside 7Orhamnoside and Isorhamnetin 3Oglucoside 7Orhamnoside the rupture of glucose from the C3 hydroxyl was noted in the first step of fragmentation
HPLC profile for 28 different polyphenols on a C18 column
Lin; L Z ; et al ; LCESIMS study of the flavonoid glycoside malonates of red clover Trifolium pratense J Agric Food Chem; 2000 482: p 35465 红三叶草
CID MS/MS spectra of kaempferol 3Orhamnosylglucosylglucoside 7Orhamnoside; MW 902
493
Positive mode
779 925
M+Na+ ions – cone voltage 25 V and collision energy 20 or 25 eV; registered with triple quadrupole analyzer
CID mass spectra of kaempferol 3Oglucosylglucoside 7Orhamnoside; MW 756
Negative mode 609
285
431
755
Product ion from MH ions – cone voltage 25 V and collision energy: 15; 20; 25 and 30 eV; registered with triple quadrupole analyzer
1 LCTSPMS重现性较差;受溶剂成分 取样杆温度及离子源温度的影响； 2 软电离技术;在谱图中只有分子离子峰;碎片非常少； 3 对分析物要求有一定的极性;流动相中要有一定量的水;对热稳定性差的化合物 有明显的分解作用
ESI 是LCMS 最常用的方法离子源
LCMS很少被用于对化合物的完全指认;而LCMS/MS用于结构鉴定 结果更可靠
Lin; L Z ; et al ; Chromatographic profiles and identification of new phenolic components of Ginkgo biloba leaves and selected products J Agric Food Chem; 2008 5615: p 66719
1974年;1674种 1980年;2721种 1993年;超过4000种 2010年;
羟基理论上都是成苷位点;但某些位点羟基更易于成苷：
7 羟基 in flavones; flavanones 与isoflavones 3; 7 羟基 in flavanols and flavanols 3; 5 羟基 in anthocyanidins 6; 8 位易连接碳苷 4位有氧原子时;5位羟基极少成苷
六 黄酮在人体内吸收 分布 代谢 排泄ADME
天然黄酮多以糖苷的形式存在;黄酮的存在形式与其吸收有密切关系 Hollman 认为槲皮素以糖苷形式较苷元吸收好;但有人持不同意见
黄酮在小肠细胞内与葡萄糖醛酸结合;然后与蛋白结合并被转运到肝脏;在肝脏中进一 步结合上硫酸盐或和甲基;从而在循环系统中有较长消除时间;半衰期达到2228h
方 法 要 点： 1 大量的标准品； 2 正 负离子模式结合； 3 离子化过程的高 低两种电压； 4 样品加酸水解;黄酮苷发生水解反应； 5 样品热处理;丙二酸酯键裂解； 6 借助文献紫外数据等
缺点 1 大量的对照品； 2 仍有一些黄酮无法鉴定
USDA Database for the Flavonoid Content of Selected Foods – 2003
黄酮化合物对ESI负离子模式更敏感;但提供的结构信息较少;而正离 子模式提供更多结构信息;两种模式结合下有利于黄酮鉴定
在0 5%甲酸做流动相改性剂可达到正离子模式下的最低检测限制;也有 人认为乙酸较甲酸能提高离子化效率
色谱保留时间也提供一些结构信息;黄酮甲基化 糖苷化种类 位点 数量影响其极性 黄酮苷较其苷元先被洗脱出；二糖苷较单糖苷先被洗脱出； 甲基化黄酮在色谱中保留时间较长
The fragmentation of the MH ions proceeds differently starting with a preferential loss of the sugar unit at C7
Davis; B D and J S Brodbelt; Determination of the glycosylation site of flavonoid monoglucosides by metal complexation and tandem mass spectrometry Journal of the American Society for Mass Spectrometry; 2004 159: p 12871299
2Hale Waihona Puke 个标准品LCMS分析MalonateFree Samples Preparation for LCMS Study
Direct extract of flower
11 A 3methylquercetin 7O Dglucoside 12 B irilone 4´O Dglucoside 16 3methylquercetin 7O Dglucoside
DAD数据同样提供结构黄酮类别信息
Sakakibara; H ; et al ; Simultaneous determination of all polyphenols in vegetables; fruits; and teas Journal of Agricultural and Food Chemistry; 2003 513: p 571581