原位合成法制造基因芯片技术概述

原位合成法制造基因芯片技术概述
【摘要】近年来，DNA微阵列原位合成技术发展迅速，成为各国学者研究的重点。

原位合成法主要包括光脱保护法、喷印合成法、光致酸合成法、电喷雾合成法、虚拟掩模法和分子印章压印法等方法。

【关键词】基因芯片；原位合成法；分子印章压印法
基因芯片的原位合成法是基于组合化学的合成原理，按精确设计的分布和顺序，通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序，运用现代高精度仪器和DNA合成化学技术在基片上直接并行定点合成所需的DNA 探针，这些合成的DNA微探针即构成了高集成度的DNA微阵列，即通称的“高密度基因芯片”。

其特点是：不仅由于集成了成千上万的密集排列的基因探针，能够在同一时间内分析大量的基因，使人们迅速地读取遗传密码，而且就同样探针数量的基因芯片来说，由于可实现大批量、低成本的集约化生产，制作成本将远低于点样法制作的寡核苷酸基因芯片，并且重复性好。

近年来，DNA微阵列原位合成以及相关技术（芯片微阵列设计及探针优化、基片修饰改性、靶基因标记方法、结果检测及分析仪器等）一直是研究的热点，代表着基因芯片的技术水平和发展趋势。

原位合成法制造基因芯片技术和方法有以下一些。

1、光脱保护法
该技术为美国Affymetrix公司首创和拥有。

根据人为合成寡核苷酸是由3’端开始而终止于5’端的特点，该技术的核心是创造性地在核苷酸单体的5’端修饰了一个光敏基团及将微电子行业的光刻技术与DNA合成技术有机地结合在一起。

在进行DNA微阵列原位合成前，先设计好各阵列点对应的探针碱基序列，整个DNA微阵列各探针的第一个碱基构成整个芯片上的第一层，第二个碱基构成第二层，……，然后按照各层碱基的分布情况每层设计四块掩模，每张掩模的透光区域分别对应于该层碱基中四种碱基中的一种。

在进行DNA微阵列合成前，还需对芯片基体材料进行一定的修饰处理。

所谓修饰处理，就是通过一系列物理和化学处理过程，使基体材料表面带有可与核酸单体3’端共价偶联的功能基团（如-OH、-CHO和-NH2等）。

表面功能基团的密度对合成效果影响很大，过密的功能基团会因空间位阻作用而降低核酸的偶联效率并妨碍随后探针与靶基因的杂交，过稀则因灵敏度的限制而检测不到靶基因。

有效解决此种空间位阻的办法是在基片与微探针之间增加一层手臂分子（arm，又称为连接分子Linker）。

手臂分子一端共价偶联于基片，另一端带有可与核酸单体3’端偶联的功能基团。

一定长度的手臂分子由于具有较大的伸展与运动空间，减小了界面反应的空间位阻，可保证较高的偶联效率和探针密度，有利于在杂交过程中得到较强的信号。

在实施DNA微阵列原位合成时，先在基片上偶联一层或若干层同种单体（如dT），然后以第一层所对应的四张掩模中的任一张覆盖其上进行光刻使被照射区
域上的光敏基团脱落，经洗涤后，在被照射区域偶联与所使用掩模对应的单体。

依此完成第一层其余三张掩模的操第一章前言作，同层四张掩模的操作完成后即完成整个一层碱基的偶联。

依此类推，直至整个DNA微探针阵列原位合成完毕。

光脱保护的优点主要体现在下述方面：首先，由于采用了微电子行业的掩模加工技术，分辨率可达到亚微米级，因此探针可达到非常高的密度，目前已可达到106/cm2阵列点的DNA探针微阵列合成水平。

其次，该技术适合自动化合成生产，Affymetrix已建有一条基因芯片自动化生产流水线。

从目前各国的情况来看，该公司已成为国际上唯一己实现了生产和销售商品化原位合成高密度基因芯片的公司。

最后，由于偶联反应在溶液中进行，因此偶联效率高。

主要缺点是：由于每张掩模都要完成一系列操作，因此耗时较长，并需要运用高精度的重复定位技术，而且由于需要专有的光敏试剂及大量的掩模加工，导致成本仍然较高。

2、喷印合成法
压电印刷法主要是美国加州IcyePhar-maceuticals公司和Protogen公司所采用，其原理类似于目前所用的喷墨打印机：打印机头在方阵上移动，方阵每点上电流使喷头放大，并将装有某种碱基的试剂滴出1pL到晶片表面，然后固定。

在洗脱和去保护后，另一轮寡核苷酸的延伸就可继续进行。

这种合成方式的各步收率超过常规的多孔玻璃合成法，一次可以合成40-50个碱基长度的寡核苷酸，大量的寡核苷酸就可构成方阵。

压电印刷法由于不需要与载体表面直接接触，故有很高的效率，但制造工艺还不太成熟。

喷印技术使液体雾化为直径为1-25微米的小珠，把这些小珠喷射在基片表面，通过移第一章前言动喷头的位置，把微量的液体分配在基片表面的不同位置。

通常的喷墨打印机由墨盒、微喷嘴以及压力发生器等组成，其中微喷嘴决定喷出的液滴的大小。

根据不同物理方法和结构，微喷头可分为压电毛细管喷头、压电微腔喷头、热压喷头、超声喷头以及压振流体喷头等类型。

比较适合于制备基因芯片的喷头为压电毛细管喷头。

该方法利用微喷头把DNA合成试剂按一定的顺序依次逐层地喷印在基片表面的不同位置上，在玻璃基片上合成DNA阵列。

3、光致酸合成法
1998年，Houston大学的Gao等提出了运用光致酸溶液进行寡核苷酸合成的方法。

其核心是以含有triarylsulfonium hexafluoroantimonate等在光照时可以产生质子的物质溶解在CH2Cl2等溶剂中作为光致酸试剂。

当将固定有核苷酸的基体材料浸泡在该种溶液中时，如果施以光照，在光照区域就会产生质子而脱去相应区域核着酸上5’端的保护基团而暴露出反应活性的5’端-OH基团，为下一个核酸单体提供了偶联位点。

此技术若能发展成熟，同样是一条经济实用的途径。

4、电喷雾合成法
纽约大学化学系和俄罗斯科学院理论与实验生物物理研究所的Morozova等在1999年报道了一种电喷雾脱保护生物探针微阵列原位合成技术。

该技术的特
点是，制作一系列带有微通孔的母板替代基于光刻技术制作的掩模，母板上微通孔的排布方式与前述掩模透光区域一致，是按微阵列合成要求而设计和制备的。

在进行生物分子微阵列合成时，将微通孔母板密合覆盖在已固定带有保护基团的基片上，脱保护试剂在电场的作用下通过微通孔母板与基片接触脱保护。

该技术发展成熟后，也不失为一条经济实用的途径。

电喷雾合成基因芯片的过程中，由于加工微孔阵列的困难，微阵列点阵密度受到限制。

此外，从报道的结果来看，可能由于受到母板和液体带电性质及孔加工的的影响，所得结果点阵大小差异较大，这将影响结果的分析处理。

另外还须特别重视的是如何实现微通孔母板与基片之间的密合，一旦密合不好，电喷雾脱保护时相邻区域之间会串流而导致微阵列原位合成失败。

5、虚拟掩模法
掩模制作是基于微电子光刻技术进行DNA微探针阵列原位合成的主要成本之一。

为了降低成本，Wisconsin大学sussman小组提出了虚拟掩模法，即采用计算机生成的明暗掩模图案替代铬板掩模直接作用于基片，可简化制造过程而降低成本。

他们采用虚拟掩模技术研制出可用于高密度基因芯片在片光定位平行合成的装置，成功地在16mm2表面上制备76，000种DNA探针，使整个基因芯片的制备时间降至8小时。

虚拟掩模法的主要缺点在于绕射作用导致边界不清晰，因而影响曝光效果，自然就影响到合成效果。

如何消除这一负面作用，是发展该技术一个迫切需要解决的问题。

如果能成功地解决，将在两方面产生重大影响：首先，可省去实体掩模的制作，因而降低了基因芯片的制备成本。

另外可省去重复定位的要求，从而简化了工艺过程，降低了成本，提高了DNA微探针合成的可靠性。

6、分子印章压印法
寡核苷酸的固相合成方法主要有亚磷酸酞胺法、氢磷酸酷法和磷酸三醋法三种。

三种方法的主要区别在于偶联反应中所使用的单体及催化剂不同。

亚磷酸酞胺法使用亚磷酸酞胺单体及四哇催化剂；氢磷酸酷法使用氢磷酸酩单体及酞氯催化剂；磷酸三醋法使用磷酸三酷单体及苯磺酸催化剂。

因而三种方法中偶联反应的机理及条件也不相同，但其余步骤的反应则大致一样。

对于寡核苷酸的固相合成，偶联反应是决定其偶联效率的最主要因素。

就三种合成方法而言，亚磷酸酞胺法最适合分子印章法DNA芯片制备中寡核苷酸的固相合成。

分子印章法制备DNA芯片是将不同图案的印章作为基片上不同位置寡核苷酸合成的模板，将亚磷酸酞胺法寡核苷酸合成路径构成一个循环，完成一个核苷延伸的偶联、封闭、氧化和脱DMT四个反应，其中每一步反应由印章压印完成并实现图形转移。

参考文献：
[1]肖鹏峰.分子印章法DNA芯片原位合成技术研究[D].南京：东南大学博士
学位论文，2002.
[2]尚春庆胡耀铭.生物芯片技术应用进展[J]. 中国基础科学.200105.
[3]谷宇何农跃.纳米金标记法在检测及基因芯片技术中的应用[J].中国药科大学学报，2003，34.
课题项目：
益阳市2004年度科技计划项目。