NGS在感染性疾病诊断中的临床应用

㊃综述㊃N G S在感染性疾病诊断中的临床应用
陈梨张丽琴谢超
皖南医学院弋矶山医院呼吸内科,芜湖241002
通信作者:张丽琴,E m a i l l i z h333333@a l i y u n c o m
ʌ摘要ɔ目前复杂的感染性疾病逐渐增加,如脑膜炎㊁肺炎㊁脓毒血症等,精准快速的
病原学诊断可以帮助临床医师及时优化抗菌药物的使用,提高治愈率㊂二代测序技术发展迅速,
为临床上感染性疾病的病原学诊断提供了非常有价值的诊断途径㊂
ʌ关键词ɔ二代测序;脑膜炎;肺部感染;脓毒血症
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C l i n i c a l a p p l i c a t i o no f n e x t-g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g i nd i a g n o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s
C h e nL i Z h a n g L i q i n X i eC h a o
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ʌK e y w o r d sɔ N e x t-g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g M e n i n g i t i s L u n g i n f e c t i o n S e p s i s
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随着医学的发展,人类发现了越来越多的疑难病例,
各种病原体的变异导致了复杂感染性疾病发生率逐渐增加,
精准快速的病原学诊断可以帮助临床医师及时优化抗菌药
物的使用,从而减少住院时间㊁提高治愈率㊁改善预后㊂
目前常用的微生物检测方法有痰涂片㊁痰培养㊁血培养㊁
脑脊液㊁胸腹水化验㊁P C R等,其中痰标本获取干扰因素较多,培养阳性率较低,检测种类有限,缺乏病原体类型㊁
致病性㊁耐药信息以及罕见或未知的新发病原体相关信息,
容易造成漏诊㊁误诊㊂故上述方法已不能有效地满足临床
需求㊂而随着二代测序(n e x t-g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g, N G S)技术的不断成熟和普及,为临床上感染性疾病的病原学诊断提供了一种新的有价值的诊断工具㊂现将N G S在临床上的部分应用进行综述㊂
1N G S
在20世纪70年代,S a n g e r等分别开发了通过链终止和片段化技术对D N A进行测序的方法,这些方法提供了破译完整基因以及整个基因组的工具,从而改变了生物学㊂S a n g e r等开发的第一代测序技术(S a n g e r测序)测序准确性高㊁读长较长,在人类基因组计划及其他领域取得重大成就,S a n g e r技术实现了2004年第一个人类基因组序列的完成[1]㊂随着科学技术的发展,第一代测序技术已不能满足目前全基因组测序的需求,因此出现了现在的新一代基因测序方法,即N G S技术,又称大规模平行测序或深度测序[2],包括第二代㊁第三代和第四代测序技术㊂目前,具有代表性的第二代测序平台有基因组测序仪㊁H i S e q2000和M i S e q㊁寡聚物连接检测测序(s e q u e n c i n g b y o l i g o l i g a t i o nd e t e c t i o n,S O L I D)5500X L㊁个人化操作基因组测序仪;第三代测序平台有H e l i S c o p e遗传分析系统和单分子实时测序技术;第四代测序技术有纳米孔测序技术[3]㊂代表性的第二代测序平台主要技术核心原理是桥式P C R和荧光可逆终止子的边合成边测序,先构建待测单链D N A 文库,形成寡核苷酸桥,进行P C R扩增㊁变性,切掉d N T P3'端延长终止基团,继续添加碱基进行测序; S O L I D测序技术是基于连接酶法,即利用D N A连接酶在连接过程中测序,单链D N A文库构建㊁微乳液P C R扩增以及连接酶测序;纳米孔测序技术为单分子测序,有高通量的G r i d I O N和U盘大小M i n I O N测序仪[4]㊂因D N A分子在电泳驱动下通过纳米微孔组成电路时可引起特征性电流变化,据此可确定D N A分子的碱基类型和排列顺序㊂其有生物纳米孔和固态纳米孔[5],后者较前者稳定性更好㊂
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现今N G S取得了令人瞩目的进展,正在发展成为分子显微镜,几乎涉及生物医学研究的每个领域[6]㊂
2N G S在中枢神经系统感染中的应用
单核细胞增生李斯特菌是一种革兰阳性㊁兼性细胞内细菌,可以污染食物,摄入后可导致多种动物感染,包括牲畜和人类㊂单核细胞增生李斯特菌感染的严重程度取决于细菌菌株的毒力和宿主的免疫状态[7]㊂由单核细胞增生李斯特菌引起的脑炎虽很罕见,但有时是致命的㊂使用常规脑脊液测试很难早期诊断,而N G S越来越多地用于检测病原体㊂Y a o等[8]收集了2014年1月至2014年10月期间入住北京协和医院的3例临床疑似李斯特菌脑膜脑炎的患者,征得同意后将3例患者纳入研究㊂在给予抗生素治疗之前,按照标准程序收集脑脊液,快速冷冻并在-20ħ下储存㊂此3例急性/亚急性脑膜脑炎患者磁共振成像和血培养提示疑似单核细胞增生李斯特菌的诊断,而脑脊液培养是阴性的㊂在以上3种情况下,对收集的脑脊液进行N G S 鉴定并测序,显示符合单核细胞增生李斯特菌的读数,并且获得了后期P C R检测结果的验证㊂首次报道了N G S在中枢神经系统李斯特菌感染中的应用㊂李斯特菌脑炎通常呈现双相病程㊂前驱症状包括发烧㊁头痛㊁恶心㊁呕吐,然后发展为进行性神经系统症状,甚至发展到呼吸衰竭[9]㊂此报道中有2例患者发生呼吸衰竭㊂因此,早期明确诊断和适当的早期抗生素治疗对预后至关重要㊂
王小娟等[10]为明确5例中枢神经系统感染患者的致病微生物,采用血液与脑脊液常规㊁生化㊁细胞学㊁培养㊁革兰染色等检测方法,应用B G I S E Q-100测序平台进行脑脊液病原体测序㊂利用P r e m i e r设计了2对引物进行P C R 验证,扩增后采用A B IP r i s m a3730X L型基因分析仪对其进行测序分析㊂脑脊液N G S共检测到李斯特菌的核酸序列数57~2611条,平均7308条㊂样本检出李斯特菌序列数与检出微生物核酸总序列比值为1508%~9084%,平均6021%,检测深度为1,基因覆盖度为023%~1400%,平均380%㊂N G S在李斯特菌检测方面具有优势,在较低基因组覆盖下也可有效识别出细菌病原体[11]㊂病毒性脑炎是遗传性原发性免疫缺陷患者发病和死亡的主要原因,如X连锁性丙种球蛋白血症[12]㊂F r e m o n d等[13]报道了星状病毒感染的脑膜炎病例㊂患有X连锁性丙种球蛋白血症的14岁男孩,维持每3周高效价丙种球蛋白注射治疗,表现为进行性认知功能障碍㊁复发性癫痫发作,脑脊液㊁血液㊁痰和粪便等未发现病毒㊂脑脊液分析白细胞计数㊁葡萄糖水平和蛋白质水平是正常的,P C R和R T-P C R是阴性的,右侧额叶脑组织活检㊁组织学结果无特异性㊂采用N G S进行深度测序并进行分析,鉴定了星状病毒基因组大片段,显示出与V A1/HMO-C进化枝高水平同源性,获得了完整的基因组,并将该新菌株命名为HA s t V-V A1/HMO-C-P A㊂更改治疗方案联合静脉注射利巴韦林治疗,患者运动行为㊁认知得到改善㊂N G S其中一个主要优点就是不仅限于细菌病原体,还可以检测鉴定真菌和病毒[14-15]㊂N G S在疾病诊断中的可用性越来越高㊂3N G S在肺部感染中病原体检测作用
肺部感染病发率较高,是临床很常见的呼吸系统感染性疾病,治疗不及时会发展为重症肺炎㊁呼吸衰竭等,预后很差,病死率高,严重威胁人类健康㊂H e等[16]报告了3例侵袭性肺曲霉菌病(i n v a s i v e p u l m o n a r y a s p e r g i l l o s i s, I P A),其传染性强,病死率高㊂但I P A的临床诊断却很困难,很难获得微生物学证据㊂患者行常规的抗感染治疗症状未见好转㊂对以上3例患者进行支气管肺泡灌洗,使用N G S对支气管肺泡灌洗液(b r o n c h o a l v e o l a r l a v a g ef l u i d, B A L F)进行测试㊂在收到样品后48h内,N G S即检测到3例患者B A L F中烟曲霉的序列读数㊂其中2例患者B A L F 中的曲霉半乳甘露聚糖检测为阳性,1例患者使用传统方法检测为阴性,包括血清半乳甘露聚糖检测和B A L F半乳甘露聚糖检测均为阴性,痰培养未发现真菌㊂即使接受治疗,患者仍有反复发热㊁咳痰㊁胸闷等症状,最后B A L F 通过N G S检测到烟曲霉,证实为I P A㊂3例患者均给予伏立康唑抗真菌治疗,上述症状逐渐好转,复查胸部C T病灶明显吸收㊂I P A是一种致命的机会性真菌感染,常发生于血液系统恶性肿瘤患者㊂然而在非传统宿主中也报道了许多I P A病例,尤其是C O P D患者[17]㊂在这些非中性粒细胞减少患者中,更容易发生误诊事件[18]㊂因此,早期明确肺曲霉菌病诊断具有重要意义㊂P a r i z e等[19]报道了一项多中心前瞻性研究,采用N G S技术对101例免疫缺陷患者进行病原体检测,同时送检血清㊁咽拭子㊁穿刺液体等标本㊂该前瞻性研究结果表明N G S较传统检测方法有较高的检出率以及更高的阴性预测值(64/65,95%C I:095~1)㊂N G S可检测出更多临床相关的病毒和细菌㊂因此,N G S是免疫功能受损或免疫缺陷患者病原体诊断的前景方法㊂P e n d l e t o n等[20]使用宏基因组学检测呼吸道病原体,报道了患有结缔组织病相关间质性肺炎的41岁女性患者和59岁败血症男性患者,使用宏基因组测序分别快速检测出铜绿假单胞菌菌株和金黄色葡萄球菌菌株㊂N G S在加速和改善临床常见致命疾病的诊断和治疗方面具有很大潜力㊂结核分枝杆菌在肺部感染的病原体中也占据了重要部分㊂N o m u r a等[21]进行了一项回顾性研究,在心脏手术期间暴露于受污染的加热器-冷却器装置的患者容易感染分枝杆菌嵌合体(M c h i m a e r a)㊂抗酸杆菌培养的诊断金标准通常需要侵入性取样㊂研究人员采用N G S方法对10例曾做过心脏手术的患者的血浆进行检测,同时对获取的标本进行抗酸杆菌培养㊂血浆N G S检测到10例患者中有9例患有侵袭性疾病,其检测所需的中位时间为4d㊂其中7例患者血浆N G S是第一个提供M c h i m a e r a感染病原学确认的试验㊂相反,抗酸杆菌培养物转为阳性所需的中位时间为20d,确认M c h i m a e r a的中位时间为41d㊂该队列中获得的24个抗酸杆菌血培养物中,仅4个(17%)为阳性㊂其中90%的患者进行了侵入性手术,并且仅在5例患者(50%)的标本培养中提示了分枝杆菌生长㊂M c h i m a e r a感染的患者因潜伏期较长以及其非特异性症状而不易被识别[22]㊂因此血浆N G S可以比抗酸杆菌培养物更快更准确
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地检测M c h i m a e r a,使其成为一种很有价值的新型诊断工具㊂另一方面,结核分枝杆菌耐药也是全世界主要的健康问题之一㊂K o等[23]应用N G S对易感结核分枝杆菌菌株和耐药菌株进行遗传分析,并通过估算N G S的阳性预测值和阴性预测值来检测菌株的耐药性㊂研究人员在H a l l y m大学医学中心收集了36株从临床标本中分离的结核菌株,通过培养基制作㊁核酸提取㊁P C R和基因测序㊁生物学信息分析㊁估计预测值及统计分析综合程序得出结果,共有24种变体与耐药性相关,基因型和表型都一致对异烟肼㊁利福平㊁乙胺丁醇敏感,对链霉素㊁阿米卡星反应较差,所有药物类别阴性预测值均大于97%,而阳性预测值为44%~ 100%㊂该研究成功地应用N G S进行了结核分枝杆菌耐药性㊁敏感菌株的遗传分析,获得了多态性和可能多态性列表,有可能成为在分枝杆菌试验中应用N G S的测试指导㊂肺部感染的病原体很多,其中病毒感染也占据了重要的位置,而且病毒结构非常简单,且更易突变,临床上不易检测到㊂Y a n g等[24]使用大量寡核苷酸探针来富集34种呼吸D N A和R N A病毒的序列,减少N G S数据中的非病毒读数并实现了基于N G S测序病原体鉴定的高性能㊂N G S 在靶向检测呼吸道病毒方面使用l l u m i n aM i S e q系统扩增和测序富集文库,实现了与分子测定相当的病毒检测灵敏度,并获得了每种病毒的部分甚至完整的基因组序列以获得精准的基因分型和变体分型㊂W o l l a n t s等[25]报道了1例中老年男性感染西尼罗河病毒,它是一种广泛存在的全球再生病原体,感染初始可能仅有流感样症状,随着病情发展可导致多脏器功能衰竭等危重情况㊂入院血象㊁尿沉渣㊁胸片㊁超声等均正常,对B A L F进行多重P C R检测,结果显示22种不同的呼吸道病原体呈阴性㊂结核分枝杆菌的单重P C R结果也为阴性㊂免疫荧光和P C R检测卡式肺囊虫的结果仍是阴性㊂脑脊液分子诊断结果显示13种病原体呈阴性,血清学检测显示12种病原体呈阴性㊂采取N G S对B A L F样本和病毒培养物进行检测,对N G S结果分析,确定了完整的西尼罗河病毒基因组(11060n t)㊂并且在B A L F标本和细胞培养物上进行新的R N A提取和新开发引物逆转录P C R,并进行S a n g e r测序,该阳性标本序列与来自N G S获得的完整基因组的序列相同㊂分子检测是用于诊断呼吸道病毒性病原体的金标准方法,N G S较R T-P C R相比可提供更多的病毒序列和分型信息㊂所以,在传统方法检测病原体阴性时,N G S可成为识别临床标本中未知病原体的有力工具㊂
4N G S在脓毒血症中进行病原体检测
脓毒症是由血流感染所引起的临床综合征,并且脓毒性休克是患者对治疗措施反映出治疗不佳的一种临床表现[26]㊂脓毒血症患者病死率在全球范围内很高,尤其是在不能及时明确病原体和抗生素非合理使用的情况下病死率会进一步增加[27]㊂A b r i l等[28]报道了1例牧羊犬咬伤的60岁男性患者,1周后出现体温升高㊁心率加快㊁血压下降,经验使用广谱抗生素治疗㊂入院血培养阴性,脑脊液革兰染色和单纯疱疹病毒P C R均为阴性㊂收集患者血浆标本进行N G S,24h内N G S分析检测到高水平微生物D N A,其读数沿整个犬咬二氧化碳嗜纤维菌(Cc a n i m o r s u s)基因组排列,检测出Cc a n i m o r s u s,之后并对血培养物分离进行16S r R N A测序确认㊂该病例首次报告了其在脓毒症重症患者中的应用,突出了N G S在临床有限时间范围内提供相关诊断性数据的巨大希望,并对改善抗生素治疗具有重要意义㊂
G r u m a z等[29]报道了1篇关于N G S技术应用于脓毒症患者病原体检测的观察性研究,纳入了25例患者,其中包括7例脓毒症患者㊁12名健康志愿者㊁6例接受过腹部手术的患者(在该研究中分析了不同时间点的血浆),总计62份血浆样本,同时进行厌氧血培养㊁需氧血培养㊁P C R 检测㊁伤口拭子㊁导管和粪便标本培养,以及N G S对血浆标本进行检测㊂脓毒性休克患者的c f D N A浓度水平增加(平均19723μg/L),尤其在脓毒症发病期间(平均37730μg/L);并且与对照组相比发病期间脓毒症患者的平均分类读数较高(982%),明显高于健康组(350%)和腹部手术前组(264%),这表明脓毒症患者细菌负荷较高㊂而且在血浆样本中发现了来自致病细菌显著水平的D N A片段,检测出病原体有阴沟肠杆菌㊁金黄色葡萄球菌㊁单纯疱疹病毒㊁肺炎克雷伯菌㊁脆弱拟杆菌,并在28d试验期内完善通过传统方法检测到的病原体数据,其与N G S检测结果匹配,从而得到证实㊂所以,该方法有望成为脓毒血症患者比较有前景的诊断方式㊂
5结语与展望
现今感染性疾病发病率越来越高,随之而来的疑难病原体感染发生率也逐渐增加,从而加大了临床医师诊治的难度㊂若诊断不明确㊁治疗不及时,病情会迅速进展,乃至发生重症炎症㊁多脏器功能衰竭等危重疾病,甚至死亡㊂N G S技术不断发展,改变了基因组分析,为临床微生物实验室的应用开辟了很多新机会,其快速无偏的特性补充了传统方法检测病原体的不足,有很好的临床使用价值㊂但N G S目前仍缺乏相关公认的标准,又因价格较昂贵,临床上仍以传统方法检测为主,目前N G S总体使用率仍不高㊂但随着社会的快速发展,有理由相信N G S在未来临床感染性疾病中的使用会更加广泛,利用其快速精准明确病原体的优势,成为临床上一项重要的医学检验技术㊂
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献
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f a i l u r eu s i n
g n e x t-g e n e r a t i o ns e q u e n c i n g J J C l i n V i r o l
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s e q u e n c i n g t o d e t e c t v a r i a n t s o f d r u g-r e s i s t a n t M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s g e n o t y p e-p h e n o t y p ec o r r e l a t i o n
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E m e r g I n f e c tD i s201824122380-2382D O I103201
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26朱磊刘健郭鸿等脓毒症休克的国内研究文献可视化分析 基于社会网络分析和战略坐标图J中华重症医学电
子杂志网络版20195132-38D O I103877c m a j
i s s n2096-1537201901007
Z h uL L i u J G u oH e t a l T h e v i s u a l i z e d a n a l y s i s o f d o m e s t i c r e s e a r c ho ns e p t i c s h o c k J Z h o n g h u aZ h o n g Z h e n g Y iX u e
D i a nZ i Z aZ h i W a n g L u oB a n20195132-38D O I10
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b l o o d s t r e a mi n f e
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s h o c ka n di n a p p r o p r i a t ea n t i b i o t i ct h e r a p y o ns u r v i v a l J
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g e n e r a t i o ns e q u e n c i n g J O p e n F o r u m I n f e c tD i s20163
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G e n o m e M e d2*******D O I101186s13073-016-
0326-8
收稿日期2019-07-18
㊃349㊃
国际呼吸杂志2020年6月第40卷第12期I n t JR e s p i r,J u n e2020,V o l.40,N o.12
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