雷帕霉素对高糖诱导人晶状体上皮细胞氧化应激的保护作用

雷帕霉素对高糖诱导人晶状体上皮细胞氧化应激的保护作用齐鹏;孙丹宇;包赫;姜仕先
【摘要】目的探讨雷帕霉素对高糖诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLECs)氧化应激的影响.方法建立高糖诱导的HLECs氧化损伤模型,用不同浓度(10 nmol·L-1、100 nmol·L-1)雷帕霉素干预,CCK-8比色法检测细胞存活率,倒置显微镜观察细胞形态并拍照,H2DCFDA检测细胞内活性氧水
平,Western Blotting检测各组凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达情况.结果 CCK-8检测结果显示,用10 nmol·L-1、100 nmol·L-1雷帕霉素处理后,HLECs存活率分别提高到62.86％±3.45％和77.47％±4.21％,与高糖组(42.32％±3.10％)比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05);H2 DCFDA荧光探针染色结果显示,雷帕霉素处理后HLECs内活性氧生成量下降,氧化损伤细胞减少;此外,雷帕霉素可以抑制高糖诱导的HLECs内凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达,抑制效应与剂量正相关.结论雷帕霉素可以抑制高糖诱导的HLECs氧化损伤及凋亡的发生,对糖尿病性白内障具有预防作用.%Objective To investigate the effects of rapamycin on human lens epithelial cells (HLECs) against high glucose-induced oxidative
stress.Methods A oxidative damage model of HLECs induced by high glucose was established,and intervention with different concentrations of rapamycin for the cells was performed for detecting the survival rate by CCK-8 assay,observing cell morphology by inverted microscope,and measuring the level of intracellular reactive oxygen species (ROS) by
H2DCFDA staining,as well as determining the expression of apoptosis related Bcl-2 and Bax proteins by Western blot in all groups.Results CCK-8 results showed that the survival rate of HLECs was increased to 62.00％±
3.74％ and 79.57％± 5.26％after treated with 10 nmol · L-1 and 100 nmol · L 1 rapamycin,and the difference was statistically significant when compared with the high glucose group (42.32％± 3.10％) (all P ＜
0.05);H2DCFDA fluorescent probe staining demonstrated that rapamycin could suppress ROS generation in HLECs and alleviate oxidative damage to cells;besides,rapamycin could downregulate the expression of Bcl-2 and Bax protein in HLECs and the inhibitory effects were positively correlated with the concentration of rapamycin.Conclusion Rapamycin can inhibit high glucose-induced oxidative damage and apoptosis m human HLECs,which provides a prevention effect for diabetic cataract.
【期刊名称】《眼科新进展》
【年(卷),期】2018(038)003
【总页数】4页(P235-238)
【关键词】雷帕霉素;高糖;人晶状体上皮细胞;细胞凋亡
【作者】齐鹏;孙丹宇;包赫;姜仕先
【作者单位】150001 黑龙江省哈尔滨市,哈尔滨医科大学附属第四医院眼视光科;150001 黑龙江省哈尔滨市,哈尔滨医科大学附属第四医院眼视光科;150001 黑龙江省哈尔滨市,哈尔滨医科大学附属第四医院眼视光科;150001 黑龙江省哈尔滨市,哈尔滨医科大学附属第四医院眼视光科
【正文语种】中文
【中图分类】R776
糖尿病性白内障与晶状体的代谢有关，其发病率较高，进展较快，是引起糖尿病患者视力低下的主要原因。

由于现代人生活方式及饮食结构的改变，其发生率已呈上升趋势［1］。

雷帕霉素(rapamycin)是从放线菌培养液中分离的一种新型大环内酯类免疫抑制剂，具有抑制细胞凋亡、抗肿瘤细胞增殖的特性，有研究显示，雷帕霉素能有效抑制兔眼后发性白内障的形成［2-3］，但是其具体作用机制尚未见报道。

本研究通过体外实验初步研究了雷帕霉素对人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLECs)氧化损伤的影响及作用机制，以期为寻找新的临床治疗方法提供参考。

1 材料与方法
1.1 材料 HLECs(美国 ATCC公司)，雷帕霉素(中国药品生物制品检定所，纯度＞99%)，胎牛血清、DMEM培养基干粉(美国Gibco公司)，CCK-8试剂盒(德国Roche公司)，Caspase-3、Caspase-9试剂盒(南京建成生物工程研究所)，Annexin V FITC/PI凋亡试剂盒、流式细胞仪(美国BD公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术公司)，CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)。

1.2 方法
1.2.1 细胞培养及分组使用DMEM培养基和体积分数10%胎牛血清，内含青霉素100×103U·L－1、链霉素0.1 g·L－1，将 HLECs置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养，每2 d换液1次，细胞生长至近80%融合时，换用无血清DMEM 培养液后分为4组:(1)阴性对照组:正常培养液培养。

(2)高糖组:40 mmol·L－1葡萄糖溶液作用12 h。

(3)雷帕霉素组:加入雷帕霉素作用 24 h后，再加入40 mmol·L－1葡萄糖溶液作用12 h，依雷帕霉素浓度不同分为 2个亚组:10 nmol·L －1(低浓度)组、100 nmol·L－1(高浓度)组。

倒置显微镜下观察各组HLECs的形态变化，拍照并对比。

1.2.2 CCK-8法测定细胞存活率细胞接种于96孔板(每孔120 μL，细胞密度 50 ×103个·L－1)，按1.2.1分组方法培养细胞，结束后弃培养液，PBS冲洗细胞，每个培养孔按1∶10比例加入CCK-8液，酶标仪测定492 nm的吸光度(A)值，每孔测3次，取平均值。

1.2.3 H2DCFDA荧光探针标记法测定细胞内活性氧利用氧敏感荧光探针
H2DCFDA检测细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)。

HLECs接种于96 孔板内，加入10 μmol·L－1的 H2DCFDA 探针，37℃细胞培养箱内避光孵育20 min，荧光显微镜下检测细胞内ROS变化并拍照。

1.2.4 Western Blotting检测凋亡相关蛋白的表达
收集细胞提取蛋白，行100 g·L－1SDS-PAGE电泳，以GAPDH为内参照，经过聚丙烯酰胺凝胶后转移至聚偏二氟乙烯膜上，50 g·L－1脱脂奶粉4℃封闭过夜，加一抗37℃孵育1 h。

洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1 h，ECL化学发光法自显影并采集图像。

检测 Bax、Bcl-2蛋白表达水平。

1.3 统计学处理用SPSS 11.5对数据进行分析和处理，结果以均数±标准差表示，组间比较用t检验或单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 雷帕霉素对高糖致HLECs氧化损伤的影响
阴性对照组细胞存活率为96.93% ±4.62%，高糖组细胞存活率下降为42.32% ±3.10%，两组比较差异有统计学意义(P ＜0.01)。

10 nmol·L－1、100 nmol·L－1雷帕霉素组细胞存活率分别提高到62.86% ±3.45%和77.47% ±4.21%，与高糖组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05)，与阴性对照组比较差异均无统计学意义(均为 P ＞0.05)，10 nmol·L－1、100 nmol·L－1雷帕霉素组间细胞存活率比较差异无统计学意义(P ＞0.05;图1)。

图1 CCK-8法检测雷帕霉素对高糖诱导的HLECs存活率的影响。

*P ＜0.05，＊
＊P ＜0.01
2.2 雷帕霉素对高糖诱导的HLECs形态的影响阴性对照组HLECs之间连接紧密，细胞呈长梭形，细胞膜完整连续(图2A);高糖组HLECs形态改变明显，细胞体积缩小成圆形，胞体内见散在颗粒小体，细胞之间连接疏松(图2B);10 nmol·L－1、100 nmol·L－1雷帕霉素组HLECs损害程度较高糖组依次减轻，细胞形态逐渐恢复(图2C、2D)。

图2 雷帕霉素对高糖诱导的HLECs形态的影响。

A:阴性对照组;B:高糖组;C:10 nmol·L－1雷帕霉素组;D:100 nmol·L－1雷帕霉素组
2.3 细胞内ROS改变未发生氧化损伤的细胞呈暗绿色低荧光，当细胞发生氧化损伤时，细胞内ROS升高，染色后呈亮绿色高荧光。

阴性对照组未见明显氧化损伤细胞(图3A);高糖组HLECs可见明显增多的绿色高荧光，提示细胞发生氧化损伤(图3B);雷帕霉素处理后氧化损伤细胞减少，10 nmol·L－1及100 nmol·L－1雷帕霉素组 HLECs荧光强度逐渐减弱(图3C、3D)，提示雷帕霉素能够抑制HLECs 发生氧化损伤。

2.4 Bax、Bcl-2蛋白表达水平检测高糖组凋亡蛋白Bax的表达较阴性对照组明显上调，抗凋亡蛋白Bcl-2 表达下调;10 nmol·L－1、100 nmol·L－1雷帕霉素组，与高糖组比较Bax的表达下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高，效果呈剂量依赖性(图4)。

图3 荧光显微镜观察HLECs内ROS改变。

A:阴性对照组;B:高糖组;C:10 nmol·L －1雷帕霉素组;D:100 nmol·L－1雷帕霉素组
图4 雷帕霉素对HLECs内Bax及Bcl-2蛋白表达的影响。

1:阴性对照组;2:高糖组;3:10 nmol·L－1雷帕霉素组;4:100 nmol·L－1雷帕霉素组
3 讨论
白内障的形成均与晶状体上皮细胞凋亡有关，晶状体上皮细胞在晶状体的发育、代
谢、分化过程中发挥重要作用［4-5］。

为了研究白内障的发生机制并探索出更多的治疗白内障的药物，国内外学者模仿白内障的发病机制，尝试了大量方法诱导晶状体上皮细胞凋亡，如高糖、激素、化学药物、H2O2、紫外线辐射等［1］。

高
糖引起的晶状体混浊主要与以下两个方面相关:高糖环境可以激活氧化应激反应，
诱导晶状体细胞内ROS过量产生及晶状体内抗氧化物酶失活，晶状体抗氧化能力下降;高糖可导致晶状体渗透压升高并诱发糖基化反应，对组织造成严重损害［6-7］。

本研究采用40 mmol·L-1葡萄糖为诱发因素，细胞形态学观察结果显示，
正常人晶状体几乎没有凋亡细胞，40 mmol·L-1葡萄糖作用后细胞体积明显缩小，呈圆球性改变，甚至出现悬浮细胞，提示HLECs出现了凋亡。

高糖刺激HLECs导致细胞抗氧化能力下降，同时产生大量自由基及ROS，细胞内氧化代谢产物堆积导致细胞毒性损伤，过多的自由基将直接通过损伤线粒体造成HLECs细胞凋亡［8-9］。

为了能更接近人体环境，我们模拟体内环境中HLECs
的氧化应激状态，利用，40 mmol·L-1葡萄糖建立细胞高糖模型，观察雷帕霉素
对该细胞的保护作用。

细胞活力检测结果显示40 mmol·L-1葡萄糖处理的HLECs 存活率明显降低，雷帕霉素能够抑制高糖诱导的细胞损伤，其保护作用呈剂量依赖性;H2DCFDA荧光探针标记法是一种测定细胞内ROS生成量的形态学检查方法，该研究结果显示，高糖作用下HLECs内ROS表达增高，表明高糖造成了一定程
度的氧化应激损伤，雷帕霉素有效抑制了高糖诱导的氧化应激反应的发生，从而抑制了细胞凋亡。

雷帕霉素在临床上主要用于自身免疫性疾病的治疗和抑制器官移植后的排斥反应，在眼科领域已有学者将其用于白内障术后后发性白内障的防治。

雷帕霉素的保护作用机制包括调节细胞周期的进程，调控细胞生长增殖与分化［10］。

浦利军等［11］通过构建糖尿病大鼠模型，采用雷帕霉素灌胃的方式初步证实了雷帕霉素
通过提高Bcl-2、Bcl-2/Bax和降低Bax表达来抑制HLECs凋亡，从而发挥抑制
糖尿病性白内障的作用。

本研究中高糖组HLECs内Bax蛋白表达明显升高，Bcl-
2蛋白的表达明显下降，不同浓度的雷帕霉素处理后，凋亡因子表达呈现下降趋势，证实了雷帕霉素对HLECs的凋亡的抑制作用可能是通过促进抗凋亡蛋白Bcl-2的
表达和抑制促凋亡蛋白Bax的表达来实现。

综上所述，雷帕霉素对高糖诱导的HLECs的凋亡具有一定的抑制作用，抑制效应
与药物浓度呈正相关。

本研究为今后临床糖尿病性白内障的预防和治疗提供了新的干预手段。

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