抗S.paratyphi+A+O2抗原单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立
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Ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｅｃｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｔｈｅ ２Ｃ６ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｐｏｌｙｃｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ＨＲＰ ｌａｂｅｌｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｅｒｅ ｃｈｏｓｅｎ ｔｏ ｂｕｉｌｄ ｕｐ ａ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｉｎｄｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ，
ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｌｒｅａｄｙ．Ｂｕｔ，ｂｙ ｆａｒ ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｒａｒｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｂｏｕｔ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｈｐｈｉ Ａ ｕｓｉｎｇ ＥＬＩＳＡ．Ｉｎ ｏｕｒ ｓｔｕｄｙ，ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ０２ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ＆ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ ａｎｄ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｉｒｓｔｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｉｎｄｒｅｃｔ ＥＩ。ＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ．
实验室常规检测、诊断甲型副伤寒的主要方法为细菌培养、肥达氏凝集反应和 伤寒血球快速诊断。这些方法费时费力，不利于早期诊断，给流行病学专家在追踪 传染源、早期控制与临床医生早期诊断工作带来了一定的难度。以酶联免疫吸附试 验为原理建立起来的各种免疫学检测方法，特异性好、灵敏度高、操作简便、样品 处理量大，已经广泛应用于临床和食品中病原菌的检测。但是目前国内外还很少有 用ＥＬＩＳＡ方法检测甲型副伤寒沙门氏菌的报道，本研究中，我们先制备抗甲型副伤 寒沙门氏菌０２抗原的单克隆抗体和多克隆抗体，然后以此为基础建立夹心ＥＬＩＳＡ 方法，快速检测该菌。
通过以上研究工作，初步确定了甲型副伤寒沙门氏菌的２００８年硕上学位论文
优化了反应条件。其方法的稳定性和实际应用情况还有待进一步完善，以便为试剂 盒的研制打下基础。
关键词：甲型副伤寒沙门氏菌；快速检测；单克隆抗体；ＥＬＩＳＡ
ｎ
华中农业大学２００８年硕士学位论文
Ａｂｓｔｒａｃｔ
ｏｔｈｅｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ａｎｄ ｏｕｔ ｏｆ ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ．ＳＯ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｓｐｅｃｆｉｃ ｔｏ ０２ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｓ
ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ．
２．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｉｎｄｒｉｅｃｔ ＥＵＳＡ ｍｅｔｈｏｄ
ＩＩＩ
华中农业大学２００８年硕上学位论文
１．甲型副伤寒沙门氏菌单克隆抗体的制备与鉴定
甲型副伤寒沙门氏菌的菌体抗原包括０１、０２和０１２三种，其中０２抗原为该 菌所特有。我们选用甲型副伤寒沙门氏菌模式菌株５０００１，经沸水浴２ｈ后制备菌体 抗原，免疫５只６．８周龄雌性Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，经过１１次细胞融合筛选出两株分泌特异 性抗体的杂交瘤细胞株，２Ｃ６和４Ｆ１０，其腹水效价分别为１：２５６００和１：１２８００， 通过ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析，两株杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体分子量均在１８０ＫＤ左右。 ２Ｃ６和４Ｆ１０分泌的单克隆抗体不与伤寒等其它细菌发生交叉反应，为特异性针对甲 型副伤寒沙门氏菌０２抗原的抗体。
ｂｙ ｔｈｅｍ ｅｖｅｒｙ ｙｅａｒ，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ０．６ ｍｉｌｌｉｏｎ ｄｉｅ，ｂｕｔ ｍｏｓｔ ｃａｓｅｓ ａｒｅ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ． Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ９０％ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｙｐｈｏｉｄ ａｎｄ ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ ｗｅｒｅ ｔｙｐｈｏｉｄ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ， 硒ｔｈｅ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅ ｏｆ Ｖｉ ｂａｃｔｅｒｉｎ，ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｄｌｅ ｏｆ ９０ｓ ｉｎ ２０ｔｈ ｃｅｎｔｕｒｙ，ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｒ ｓｔｒａｉｎ ｃｈａｎｇｅｄ，ｉｎ ｓｏｍｅ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ｔｈｅ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｔｙｐｈｏｉｄ ｄｅｃｒｅａＳｅｄ，ｂｕｔ ｔｈａｔ ｏｆ ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ ｉｎｃｒｅａＳｅｄ ｌａｒｇｅｌｙ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｔｒｅｎｄ ｆｒｏｍ ｓｐｏｔ ｔｏ ｐａｒｔ ａｎｄ ｆｒｏｍ ｉｎｓｈｏｒｅ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ｔｏ ｂａｃｋｌａｎｄ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ．Ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ，ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ ｂｅｃｏｍｅｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｅａｓｅ ｉｎ ｓｏｍｅ ａｒｅａｓ，ａｎｄ ｏｆｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐ ｔｏ ｓｅｒｉｏｕｓ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ．Ｓｏ ｓｅｔｔｉｎｇ ｕｐ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｅｔｏｄ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ．
成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已
经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位
或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同－１＂作的同志对本研究
Ｔｙｐｈｏｉｄ ａｎｄ ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ ａｒｅ ａｃｕｔｅ ｅｎｔｅｒｉｃ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｂｙ ｆｅｃａｌ－ｏｒａｌ ｒｏｕｔｅ。ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｅｓ ａｒｅ Ｓ．ｔｙｐｈｉ ａｎｄ ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ Ａ Ｂ Ｃ．Ｔｙｐｈｏｉｄ ａｎｄ ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ ｓｐｒｅａｄ ａｌｌ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ，ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ １６—１７ ｍｉｌｌｉｏｎｓ ｐｅｏｐｌｅｓ ａｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ
ｔｈｅｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｒｅ ｔｉｍｅ—ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ，ｌａｂｏｒ－ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ，Ｃａｌｌ’ｔ ａｄａｐｔ ｔｏ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｏｓｉｓ，ｉｔ’Ｓ ｈａｒｄ ｆｏｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｓｔ ｔｏ ｔｒａｃｅ ｔｈｅ ｓｏｕｒｃｅ，ｅａｒｌｉｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌ，ａｎｄ ｆｏｒ ｃｌｉｃｉｎｉａｎ ｔＯ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ． Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｂｕｉｌｔ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ａｒｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｃａｎ ｄｅｔｅｃｔ ｖａｓｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ，ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｕｓｅｄ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ；ｒａｐｉｄ．ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＥＬＩＳＡ
华中农业大学２００８年硕士学位论文
Ｖ
华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书
学位论文 是否保密
如需保密，解密时间
年月 日
独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ Ｗａｓ ｂｏｔｌｌ ａｒｏｕｎｄ １ ８０ ＫＤ ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌ，２Ｃ６ ａｎｄ ４Ｆ１０，ｄｉｄｎ’ｔ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ
以前我国伤寒发病占伤寒副伤寒总发病的90以上后来由于伤寒疫苗的广泛使用20世纪90年代中期流行菌株发生转变我国部分省份伤寒病例逐渐下降而由甲型副伤寒沙门氏菌引起的副伤寒病例却大幅上升并呈现由散发到局部暴发由沿海省份向内地省份推进的流行趋势近几年来成为我国一些地区传染病突发事件的主要病种常发展成重大疫情急需建立快速准确的诊断方法
华中农业大学 硕士学位论文 抗S.paratyphi A O2抗原单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建
立 姓名：吕均 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：郭爱玲 20080601
华中农业大学２００８年硕士学位论文
摘要
伤寒副伤寒是由伤寒杆菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）和副伤寒杆菌甲、乙、丙（＆ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ，Ｂ，Ｃ）引起的急性肠道传染病，在全球分布很广，估计每年伤寒发病１６００万＂－＇１７００ 万，死亡６０万，主要在发展中国家。以前我国伤寒发病占伤寒副伤寒总发病的９０％ 以上，后来由于伤寒Ⅵ疫苗的广泛使用，２０世纪９０年代中期，流行菌株发生转变， 我国部分省份伤寒病例逐渐下降，而由甲型副伤寒沙门氏菌引起的副伤寒病例却大 幅上升，并呈现由散发到局部暴发，由沿海省份向内地省份推进的流行趋势，近几 年来成为我国一些地区传染病突发事件的主要病种，常发展成重大疫情，急需建立 快速、准确的诊断方法。
Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ａｂｏｖｅ，ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｉｎｄｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ Ｗａｓ ｄｅｃｉｄｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｉｎ ｆｕｔｕｒｅ，ｔｈｅ ｓｔａｂｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｌｓｏ ｎｅｅｄ ｔｏ ｂｅ ｔｅｓｔｅｄ，ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｅｔ ｕｐ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔｓ ｆｏｒ ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ。
ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ
ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｂａｔｅｒｉａｓ ｉｎ ａｎｄ ｏｕｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｌｉｍｉｔ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ １ ０３ ＣＦＵ／ｍＬ．ａｎｄ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｎｌｙ ｔａｋｅｓ ４—５ｈ． Ｉｔ ｏｆｆｅｒｅｄ ａ ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｃｃｕａｔｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｍ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｏｏｄ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．
１．Ｐｒｅｐａｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｓ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｈｒｅｅ Ｏ—ａｎｇｉｇｅｎｓ：０１，０２ ａｎｄ ０１２，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ０２ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｓ ｕｎｉｑｕｅ．Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｏｄｙ ａｎｔｉｇｅｎ Ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｂａｔｈｉｎｇ ｉｎ ｂｏｉｌｉｎｇ ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ２ｈ，ａｎｄ ｆｉｖｅ ｆｅｍａｌｅ Ｂａｌｂ／Ｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ．Ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌ，２Ｃ６ ａｎｄ ４Ｆ１０， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｓｔａｂｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ０２ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｆｔｅｒ １ １ ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｏｆ ｗｈｉｃｈ ａｓｃｉｔｅｓ ｔｉｔｅｒ ｗｅｒｅ １：２５６００ ａｎｄ １：１ ２８００
Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ＆ｐａｒａｔｙｈｐｉ Ａ ｉｎ ｌａｂ ａｒｅ ｂａｔｅｒｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｗｉｄａｌ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｙｐｈｉｏｄ ｈｅｍａｔｏｃｙｔｅ ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，
２．夹心ＥＵＳＡ检测方法的建立
用相同抗原免疫兔子，制备多克隆抗体，选用单抗２Ｃ６和ＨＲＰ标记的羊抗鼠酶 标二抗，建立检测甲型副伤寒沙门氏菌双抗夹心ＥＬＩＳＡ方法。实验结果表明，此 ＥＬＩＳＡ方法不与属内外常见致病菌发生交叉反应，特异性较好；检测限达到 １０５ＣＦＵ／ｍＬ，灵敏度高；整个检测过程４．５ｈ即可完成，为食品检验以及临床医生早 期诊断提供一种快速、灵敏、有效的方法。
ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｌｒｅａｄｙ．Ｂｕｔ，ｂｙ ｆａｒ ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｒａｒｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｂｏｕｔ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｈｐｈｉ Ａ ｕｓｉｎｇ ＥＬＩＳＡ．Ｉｎ ｏｕｒ ｓｔｕｄｙ，ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ０２ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ＆ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ ａｎｄ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｉｒｓｔｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｉｎｄｒｅｃｔ ＥＩ。ＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ．
实验室常规检测、诊断甲型副伤寒的主要方法为细菌培养、肥达氏凝集反应和 伤寒血球快速诊断。这些方法费时费力，不利于早期诊断，给流行病学专家在追踪 传染源、早期控制与临床医生早期诊断工作带来了一定的难度。以酶联免疫吸附试 验为原理建立起来的各种免疫学检测方法，特异性好、灵敏度高、操作简便、样品 处理量大，已经广泛应用于临床和食品中病原菌的检测。但是目前国内外还很少有 用ＥＬＩＳＡ方法检测甲型副伤寒沙门氏菌的报道，本研究中，我们先制备抗甲型副伤 寒沙门氏菌０２抗原的单克隆抗体和多克隆抗体，然后以此为基础建立夹心ＥＬＩＳＡ 方法，快速检测该菌。
通过以上研究工作，初步确定了甲型副伤寒沙门氏菌的２００８年硕上学位论文
优化了反应条件。其方法的稳定性和实际应用情况还有待进一步完善，以便为试剂 盒的研制打下基础。
关键词：甲型副伤寒沙门氏菌；快速检测；单克隆抗体；ＥＬＩＳＡ
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华中农业大学２００８年硕士学位论文
Ａｂｓｔｒａｃｔ
ｏｔｈｅｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ａｎｄ ｏｕｔ ｏｆ ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ．ＳＯ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｓｐｅｃｆｉｃ ｔｏ ０２ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｓ
ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ．
２．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｉｎｄｒｉｅｃｔ ＥＵＳＡ ｍｅｔｈｏｄ
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华中农业大学２００８年硕上学位论文
１．甲型副伤寒沙门氏菌单克隆抗体的制备与鉴定
甲型副伤寒沙门氏菌的菌体抗原包括０１、０２和０１２三种，其中０２抗原为该 菌所特有。我们选用甲型副伤寒沙门氏菌模式菌株５０００１，经沸水浴２ｈ后制备菌体 抗原，免疫５只６．８周龄雌性Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，经过１１次细胞融合筛选出两株分泌特异 性抗体的杂交瘤细胞株，２Ｃ６和４Ｆ１０，其腹水效价分别为１：２５６００和１：１２８００， 通过ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析，两株杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体分子量均在１８０ＫＤ左右。 ２Ｃ６和４Ｆ１０分泌的单克隆抗体不与伤寒等其它细菌发生交叉反应，为特异性针对甲 型副伤寒沙门氏菌０２抗原的抗体。
ｂｙ ｔｈｅｍ ｅｖｅｒｙ ｙｅａｒ，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ０．６ ｍｉｌｌｉｏｎ ｄｉｅ，ｂｕｔ ｍｏｓｔ ｃａｓｅｓ ａｒｅ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ． Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ９０％ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｙｐｈｏｉｄ ａｎｄ ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ ｗｅｒｅ ｔｙｐｈｏｉｄ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ， 硒ｔｈｅ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅ ｏｆ Ｖｉ ｂａｃｔｅｒｉｎ，ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｄｌｅ ｏｆ ９０ｓ ｉｎ ２０ｔｈ ｃｅｎｔｕｒｙ，ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｒ ｓｔｒａｉｎ ｃｈａｎｇｅｄ，ｉｎ ｓｏｍｅ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ｔｈｅ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｔｙｐｈｏｉｄ ｄｅｃｒｅａＳｅｄ，ｂｕｔ ｔｈａｔ ｏｆ ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ ｉｎｃｒｅａＳｅｄ ｌａｒｇｅｌｙ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｔｒｅｎｄ ｆｒｏｍ ｓｐｏｔ ｔｏ ｐａｒｔ ａｎｄ ｆｒｏｍ ｉｎｓｈｏｒｅ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ｔｏ ｂａｃｋｌａｎｄ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ．Ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ，ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ ｂｅｃｏｍｅｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｅａｓｅ ｉｎ ｓｏｍｅ ａｒｅａｓ，ａｎｄ ｏｆｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐ ｔｏ ｓｅｒｉｏｕｓ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ．Ｓｏ ｓｅｔｔｉｎｇ ｕｐ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｅｔｏｄ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ．
成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已
经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位
或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同－１＂作的同志对本研究
Ｔｙｐｈｏｉｄ ａｎｄ ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ ａｒｅ ａｃｕｔｅ ｅｎｔｅｒｉｃ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｂｙ ｆｅｃａｌ－ｏｒａｌ ｒｏｕｔｅ。ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｅｓ ａｒｅ Ｓ．ｔｙｐｈｉ ａｎｄ ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ Ａ Ｂ Ｃ．Ｔｙｐｈｏｉｄ ａｎｄ ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ ｓｐｒｅａｄ ａｌｌ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ，ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ １６—１７ ｍｉｌｌｉｏｎｓ ｐｅｏｐｌｅｓ ａｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ
ｔｈｅｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｒｅ ｔｉｍｅ—ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ，ｌａｂｏｒ－ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ，Ｃａｌｌ’ｔ ａｄａｐｔ ｔｏ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｏｓｉｓ，ｉｔ’Ｓ ｈａｒｄ ｆｏｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｓｔ ｔｏ ｔｒａｃｅ ｔｈｅ ｓｏｕｒｃｅ，ｅａｒｌｉｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌ，ａｎｄ ｆｏｒ ｃｌｉｃｉｎｉａｎ ｔＯ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ． Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｂｕｉｌｔ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ａｒｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｃａｎ ｄｅｔｅｃｔ ｖａｓｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ，ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｕｓｅｄ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ；ｒａｐｉｄ．ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＥＬＩＳＡ
华中农业大学２００８年硕士学位论文
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年月 日
独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ Ｗａｓ ｂｏｔｌｌ ａｒｏｕｎｄ １ ８０ ＫＤ ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌ，２Ｃ６ ａｎｄ ４Ｆ１０，ｄｉｄｎ’ｔ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ
以前我国伤寒发病占伤寒副伤寒总发病的90以上后来由于伤寒疫苗的广泛使用20世纪90年代中期流行菌株发生转变我国部分省份伤寒病例逐渐下降而由甲型副伤寒沙门氏菌引起的副伤寒病例却大幅上升并呈现由散发到局部暴发由沿海省份向内地省份推进的流行趋势近几年来成为我国一些地区传染病突发事件的主要病种常发展成重大疫情急需建立快速准确的诊断方法
华中农业大学 硕士学位论文 抗S.paratyphi A O2抗原单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建
立 姓名：吕均 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：郭爱玲 20080601
华中农业大学２００８年硕士学位论文
摘要
伤寒副伤寒是由伤寒杆菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）和副伤寒杆菌甲、乙、丙（＆ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ，Ｂ，Ｃ）引起的急性肠道传染病，在全球分布很广，估计每年伤寒发病１６００万＂－＇１７００ 万，死亡６０万，主要在发展中国家。以前我国伤寒发病占伤寒副伤寒总发病的９０％ 以上，后来由于伤寒Ⅵ疫苗的广泛使用，２０世纪９０年代中期，流行菌株发生转变， 我国部分省份伤寒病例逐渐下降，而由甲型副伤寒沙门氏菌引起的副伤寒病例却大 幅上升，并呈现由散发到局部暴发，由沿海省份向内地省份推进的流行趋势，近几 年来成为我国一些地区传染病突发事件的主要病种，常发展成重大疫情，急需建立 快速、准确的诊断方法。
Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ａｂｏｖｅ，ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｉｎｄｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ Ｗａｓ ｄｅｃｉｄｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｉｎ ｆｕｔｕｒｅ，ｔｈｅ ｓｔａｂｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｌｓｏ ｎｅｅｄ ｔｏ ｂｅ ｔｅｓｔｅｄ，ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｅｔ ｕｐ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔｓ ｆｏｒ ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ。
ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ
ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｂａｔｅｒｉａｓ ｉｎ ａｎｄ ｏｕｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｌｉｍｉｔ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ １ ０３ ＣＦＵ／ｍＬ．ａｎｄ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｎｌｙ ｔａｋｅｓ ４—５ｈ． Ｉｔ ｏｆｆｅｒｅｄ ａ ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｃｃｕａｔｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｍ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｏｏｄ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．
１．Ｐｒｅｐａｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｓ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｈｒｅｅ Ｏ—ａｎｇｉｇｅｎｓ：０１，０２ ａｎｄ ０１２，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ０２ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｓ ｕｎｉｑｕｅ．Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｏｄｙ ａｎｔｉｇｅｎ Ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｂａｔｈｉｎｇ ｉｎ ｂｏｉｌｉｎｇ ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ２ｈ，ａｎｄ ｆｉｖｅ ｆｅｍａｌｅ Ｂａｌｂ／Ｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ．Ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌ，２Ｃ６ ａｎｄ ４Ｆ１０， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｓｔａｂｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ０２ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｆｔｅｒ １ １ ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｏｆ ｗｈｉｃｈ ａｓｃｉｔｅｓ ｔｉｔｅｒ ｗｅｒｅ １：２５６００ ａｎｄ １：１ ２８００
Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ＆ｐａｒａｔｙｈｐｉ Ａ ｉｎ ｌａｂ ａｒｅ ｂａｔｅｒｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｗｉｄａｌ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｙｐｈｉｏｄ ｈｅｍａｔｏｃｙｔｅ ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，
２．夹心ＥＵＳＡ检测方法的建立
用相同抗原免疫兔子，制备多克隆抗体，选用单抗２Ｃ６和ＨＲＰ标记的羊抗鼠酶 标二抗，建立检测甲型副伤寒沙门氏菌双抗夹心ＥＬＩＳＡ方法。实验结果表明，此 ＥＬＩＳＡ方法不与属内外常见致病菌发生交叉反应，特异性较好；检测限达到 １０５ＣＦＵ／ｍＬ，灵敏度高；整个检测过程４．５ｈ即可完成，为食品检验以及临床医生早 期诊断提供一种快速、灵敏、有效的方法。