RFLP技术
一、RFLP概念
限制性内切酶片段长度多态性）作为第一代分子 生物学标记自问世以来已广泛运用于多门生物学 科研究中。 所谓RFLP, 是指用限制性内切酶切割不同个体基因 组DNA 后, 含同源序列的酶切片段在长度上的差异。 20 世纪70年代, 限制性内切酶的发现使DNA 变异 研究成为可能, 1974年RFLP 作为遗传工具由 Grodjicker 创立, 1980 年由Botstein 再次提出, 并由 Soller 和Beckman( 1983) 最先应用于品种鉴别和品 系纯度的测定, 这是第一个被应用于遗传研究的 DNA 分子标记技术。
1、染色体原位杂交
一种基于Southern 杂交的分子标记技术。它 利用特异性核酸片段作探针, 直接同染色体 DNA 片段杂交, 在染色体上显示特异DNA。
可采用同位素标记探针, 杂交后通过放射自 显影显示杂交信号。 也可以采用非放射性大分子如生物素、地 高辛等标记特异核酸片段, 杂交信号经酶联 显色或荧光显色得以显示。
四、R F L P 技术的基本步骤
1、靶D N A 的准备。先将基因组D N A 抽提出来, 选用合
适的限制性核酸内切酶酶解基因组D N A , 将酶解出来的 具有各种长度的D N A 片段在琼脂搪凝胶电泳分离, 使其 按片段的长短排列, 将D N A 片段变性后转移至硝酸纤维 膜或尼龙膜上,称印迹(So u t he r n b l o t ) 转移, 并在8 0 ℃ 烘烤或用长波紫外线照射, 将D N A 固定在膜上。 2、核酸探针的标记。将准备作为探针的D N A片段纯化 (这些D N A 片段可以是基因组D N A 的一个片段, 或是c D N A , 或是人工合成的寡核昔酸) , 用放射性元素(如Q 一32 p ) 或非放射性元素(如n ig 一d U T P 等) 标记, 经纯化后再 用。 3 、杂交显示。将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜 上的单链核酸杂交, 洗膜去除未杂交的标记探针后, 进行 放射自显影或加人酶的底物进行显色反应, 再对显示出来 的谱带进行分析。
RFLP
限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。
它是第一代DNA分子标记技术。
Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。
DNA 分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。
RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。
RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。
所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。
当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。
分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。
分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。
不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。
常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。
分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。
构建饱和图谱是 RFLP 研究的主要目标之一。
1 原理该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，对于不同种群的生物个体而言，他们的DNA序列存在差别。
如果这种差别刚好发生在内切酶的酶切位点，并使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。
RFLP和RAPD技术原理和操作步骤
RFLP和RAPD技术原理和操作步骤原理：DNA分⼦⽔准上的多态性检验测定技术是施⾏基因组研讨的基础。
RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限⽌断⽚长度多态性)已被⼴泛⽤于基因组遗传图谱构建、基因定位以及有⽣命的物质⾼级演化和分类的研讨。
RFLP是依据不⼀样品种（个体）基因组的限⽌性内切酶的酶切位点碱基发⽣突变，或酶切位点之间发⽣了碱基的插进去、缺失，造成酶切断⽚体积发⽣了变动，这种变动可以经过特别指定探针杂交施⾏检验测定，因此可⽐较不⼀样品种（个体）的DNA⽔准的差别（即多态性），多个探针的⽐较可以稳固建⽴有⽣命的物质的⾼级演化和分类关系。
所⽤的探针为出处于同种或不⼀样种基因组DNA的克隆，位于染⾊体的不⼀样位点，因此可以作为⼀种分⼦标记(马克)，构建分⼦图谱。
当某个性状（基因）与某个（些）分⼦标记协同离合时，表明这个性状（基因）与分⼦标记连锁。
分⼦标记与性状之间交换值的体积，即表达⽬的基因与分⼦标记之间的距离，因此可将基因定位于分⼦图谱上。
分⼦标记克隆在质粒上，可以蕃息及保留。
不⼀样限⽌性内切酶割切基因组DNA后，所切的断⽚类型不同，因为这个，限⽌性内切酶与分⼦标记组成不⼀样组合施⾏研讨。
常⽤的限⽌性内切酶普通是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,⽽分⼦标记则有⼏个甚⾄于上千个。
分⼦标记越多，则所构建的图谱就越达到最⾼限度。
构建达到最⾼限度图谱是RFLP研讨的主重要的条⽬标之⼀。
使⽤随机引物扩增寻觅多态性DNA断⽚可作为分⼦标记。
这种办法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。
尽管RAPD技术诞⽣的时间很短, 但因为其独有特别的检验测定DNA多态性的形式以及迅速、简单⽅便的独特的地⽅,使这个技术已渗透于基因组研讨的多种⽅⾯。
该RAPD技术树⽴于PCR技术基础上,它是利⽤⼀系列(⼀般数百个)不⼀样的随机排列碱基顺着次序的寡聚核苷酸单链(⼀般为10聚体)为引物,对所研讨基因组DNA施⾏PCR扩增.聚丙烯酰胺或⽯花胶糖电泳离合,经EB染⾊或放射性⾃显影来检验测定扩增加产量物DNA断⽚的多态性,这些个扩增加产量物DNA断⽚的多态性反映了基因组相应地区范围的DNA多态性。
酶联荧光RFLP技术标准
酶联荧光RFLP技术标准1 全血或冻溶血抽提DNA1.1 全血溶解注：1）细胞溶解液（cell Lysis Buffer）和蛋白酶K（pro-k）在使用时，置放在冰盆内。
2）蛋白溶解液（Protein Lysis Buffer）应放在室温。
3）操作中全部试剂的用量是依据0.5ml血液样本而设定的，应精确保用各试剂用量。
①移取0.5ml全血，加入标记5ml管。
②加1.8ml细胞溶解液到各试验管，加盖，倒转数次使其混匀，置于冰盆内待到全部试验样本操作完备后，准备离心。
③在水平台式离心机上离心，1250rpm，离心时间5min，注意在离心前一定要配平。
④从离心机取出样本，仔细地倒去上清液，用新华滤纸吸取残剩上清液。
注意，不要将离心沉淀物（pellet）丢掉。
假若沉淀物被悬浮，就将样本管垂直放置，小心吸弃上清液。
⑤在旋涡混合器上，用残存上清液悬浮沉淀团。
⑥每样本管加2ml细胞溶解液，加盖，在旋涡混合器上，混匀沉淀团，重复第3-4步骤。
⑦再在旋涡混合器上，混匀样本。
⑧在第6步骤离心时，按下列配方准备蛋白酶混合液。
每个样本×10 ×20 ×30 ×40 ×50 ×60 Protein233.8μl 2.338ml 4.676ml 7.014ml 9.352ml 11.69ml 14.028ml lysisBufferPro-k 3.7μl 37μl 74μl 11μl 140μl 185μl 222μl SDS 12.5μl 125μl 250μl 375μl 500μl 625μl 750μl Total 250μl 2500ml 5ml 7.5ml 10ml 12.5ml 15ml⑨每样本管加蛋白酶混合液250μl，加盖，轻轻地倒转数次，禁止剧烈振荡。
⑩将全部样本管放入恒温水浴摇床内，37±1℃培养2hrs，中速摇动。
⑾每管加50μl高氯酸钠（Sodium Porchlorate）加盖，轻轻地倒转数次，进入抽取步骤。
PCR-RFLP
步骤
• • • • • ( 1) 选择目标序列 ( 2) 设计特异引物 ( 3) PCR扩增 ( 4) 酶切 ( 5) 琼脂糖电泳分离与鉴定
特点
• (1) 引物与限制性内切酶组合非常多, 增加了揭示多态性的 机会,而且操作简便,可用琼脂糖电泳分析; • (2) 在真核生物中,CAPS标记呈共显性, 即可区分纯合基因 型和杂合基因型; • (3) 所需DNA的量很少, 且对DNA的浓度要求不严格; • (4) 使用的引物较长, 扩增的结果比较稳定且避免了RFLP 分析中膜转印这一步骤, 又能保持RFLP分析的精确度; • (5) 操作简便、快捷和自动化程度高。
PCR-RFLP
分子标记
• 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的 遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接反映。 • 某种意义上分子标记也指DNA分子标记, 就是指能反映生 物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。它能 够直接反映基因组DNA间的差异。
原理
• PCR-RFLP是酶切扩增多态性序列标记技术, 又称为 CAPS, 主要是对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切分 析。它是根据EST或已发表的基因序列等设计特异引物, 将特异PCR与限制性酶切相结合而检测多态性的一种技术。 • 基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异 性的PCR引物( 19~27bp) , 然后用这些引物扩增该位点上 的某一DNA片段,接着用专一性的限制性内切酶切割所得 扩增产物,凝胶电泳分离酶切片SCP的比较
应用
• 植物基因分型、定位、克隆、分子鉴定和动物的遗传多样 性、品种鉴定以及微生物的连锁图谱和品种鉴定等方面。
小概念
• DNA的多态性(不同个体间基因组的核苷酸序列存在的差 异性)可影响限制酶的切割位点，造成限制性片段长度多 态性，即用同一种限制酶消化不同个体的DNA时，会得到 长度各不相同的限制性片段类型。不同个体基因组在同一 段DNA是否有同样的酶切位点，决定了酶切后是否产生同 样大小的片段。当碱基组成的变化改变了限制酶的识别位 点时，就会得到不同的限制性片段类型，这样的位点称为 多态性位点。
RFLP名词解释
RFLP名词解释RFLP是限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）的缩写，是一种分子生物学技术，常用于分析DNA样本中的基因型。
下面对RFLP进行详细解释，包括其原理、应用和优缺点。
RFLP技术是基于DNA序列的差异来检测个体间的基因型差异。
它利用了DNA序列中的限制性内切酶剪切位点的多态性，通过对DNA样本进行酶切和凝胶电泳，分析得到的DNA片段长度的差异来判断个体的基因型。
RFLP技术的原理如下：1. 获取DNA样本：从个体的细胞中提取DNA样本，可以通过多种方法如血液、唾液、组织样本等获得。
2. DNA酶切：用特定的限制性内切酶对DNA样本进行酶切。
限制性内切酶是一种具有特异性的酶，它会识别和切割特定的DNA序列。
如果个体的DNA序列中存在特定的切割位点，则酶切会产生不同长度的DNA片段。
3. 凝胶电泳：将经过酶切的DNA样本加载到凝胶电泳槽中，经过电场离子迁移，分离出不同长度的DNA片段。
4. 可视化和分析：通过染色或探针杂交等方法，对电泳结果进行可视化，并进行分析确定DNA片段的长度。
RFLP技术得以应用于诸多领域，具有以下几个主要的应用方面：1. 遗传病分析：RFLP技术可以用于检测导致遗传病的基因突变。
通过分析DNA序列中的限制性内切酶位点是否发生改变，可以确定个体是否携带突变基因，并判断其患病风险。
2. 亲子鉴定：利用RFLP技术可以对个体的DNA样本进行比对，确定亲子关系。
通过对父母和子女DNA样本的酶切和电泳分析，可以判断是否存在一致的DNA片段长度，从而确定亲子关系。
3. 种群遗传学研究：通过对不同个体的DNA样本进行RFLP 分析，可以判断不同个体之间的基因型差异，从而对种群内的遗传多样性进行研究，了解不同种群的遗传背景及遗传演化。
4. 进化与系统发生关系研究：RFLP技术可以用于研究不同物种或亚种之间的进化关系。
rflp原理
rflp原理RFLP原理。
RFLP（Restrition Fragment Length Polymorphism）是一种分子生物学技术，它是利用限制性内切酶切割DNA，通过分析DNA的特定序列长度差异来进行基因分型和遗传多态性研究的方法。
RFLP 技术在基因组学研究、疾病诊断和法医学鉴定等领域有着广泛的应用。
首先，RFLP技术的原理是基于DNA序列的差异性。
DNA序列中存在着许多的限制性内切酶切位点，当DNA经过限制性内切酶的切割作用后，会产生不同长度的DNA片段。
这些不同长度的DNA片段就构成了RFLP技术的研究对象。
而DNA序列的差异性来源于基因组中的多态性位点，即在不同个体中，同一位点上的DNA序列存在着不同的碱基组成，从而导致了限制性内切酶切割后的DNA片段长度差异。
其次，RFLP技术的步骤包括DNA提取、限制性内切酶切割、电泳分离和杂交探针检测。
首先是DNA提取，从样本中提取出待研究的DNA，然后通过限制性内切酶切割，将DNA切割成不同长度的片段。
接着是电泳分离，将切割后的DNA片段进行电泳分离，根据不同长度的片段在凝胶中的迁移速度来进行分离。
最后是杂交探针检测，将特定的DNA探针与目标DNA片段进行杂交，通过探针的特异性结合来检测目标DNA片段的存在与否。
再次，RFLP技术的应用非常广泛。
在基因组学研究中，RFLP技术可以用于构建遗传图谱、进行基因定位和克隆等研究。
在疾病诊断中，RFLP技术可以用于检测遗传病变和基因突变，对于一些遗传性疾病的诊断具有重要意义。
在法医学鉴定中，RFLP技术可以通过DNA指纹分析来进行个体识别和亲子鉴定，为司法鉴定提供了可靠的技术手段。
最后，RFLP技术虽然在过去曾经是基因分型和遗传多态性研究的主要方法，但随着PCR技术和基因芯片技术的发展，RFLP技术的应用逐渐减少。
然而，RFLP技术仍然具有一定的优势，例如在一些特定的基因分型和遗传多态性研究中，RFLP技术仍然是不可替代的。
rflp的基本原理
rflp的基本原理RFLP是指限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism），是一种基于DNA序列的分子生物学技术。
它可以检测DNA序列中存在的多态性，即不同个体之间的DNA序列差异。
RFLP技术被广泛应用于基因组学、遗传学、医学等领域。
一、RFLP的基本概念1.1 限制性酶限制性酶又称为切割酶，是一种能够识别特定DNA序列并将其切割成特定长度片段的酶。
1.2 片段长度多态性片段长度多态性指的是同一基因在不同个体中由于存在不同位点上的限制性酶切割位点而产生不同大小的DNA片段。
二、RFLP技术流程2.1 DNA提取和纯化首先需要从样品中提取出DNA，并进行纯化处理，以保证后续实验中得到高质量的DNA样品。
2.2 限制性酶切割将提取出来的DNA与特定的限制性酶进行反应，使其在特定位点上进行切割形成DNA片段。
2.3 凝胶电泳分离将反应后得到的DNA片段通过凝胶电泳进行分离，根据片段长度的不同，在凝胶中形成不同大小的DNA条带。
2.4 转膜将凝胶上的DNA条带转移到膜上，以便进行进一步的检测和分析。
2.5 探针杂交使用特定的DNA探针与转移后的DNA片段进行杂交反应，通过探针与DNA片段之间的互补配对来检测目标基因是否存在多态性。
2.6 检测和分析通过显色、放射自显影等方法来检测和分析DNA条带，确定目标基因在不同个体中是否存在多态性。
三、RFLP技术优缺点3.1 优点（1）可以检测到基因组中存在的多态性，有助于研究遗传疾病、物种起源等问题；（2）技术成熟，操作简单易行；（3）对样品来源没有特殊要求，可以从各种生物体中提取DNA样品进行检测。
3.2 缺点（1）需要使用大量限制性酶，并且每个限制性酶只能识别特定的DNA序列，对于大规模筛查较为困难；（2）需要使用放射性标记的探针进行检测，存在一定的危险性；（3）需要较长时间进行实验操作，不适用于快速筛查。
RFLP技术
优缺点及基本类型
优缺点： RFLP遍布低拷贝编码序列，并且非常稳定，但RFLP实验操作繁 琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模的分子育种，在植物分子 标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。 与核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中许多非常繁琐工序， 但相对RAPD 而言，RFLP方法更费时、费力，需要进行DNA多种酶 切、转膜以及探针的制备等多个步骤，仅对基因组单拷贝序列进行鉴 定。但RFLP又有比RAPD优越之处， 它可以用来测定多态性是由父 本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由 碱基突变或倒位、 还是由缺失、插入造成的。 基本类型： 1.点的多态性 表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切 位点的丢失或形成一个新的酶切位点。Southern杂交即可诊断。 2.序列多态性 因DNA链内发生较大部分的缺失 重复 插入等变异，其结果是即 使其内切酶位点碱基序列没有变化，但原有的内切酶位点相对位置发 生变化从而导致RFLP。
RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性 片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、 重排或点突变所引起的。 RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）即限制性内 切酶片段长度多态性，作为第一代分子生物学标记自问世以来已广泛运 用于多门生物学科研究中，但它运用于植物抗性研究还只是近几年的事。 RFLP能对植物的抗性基因进行定位和分离，利用RFLP技术，对于核 基因组或叶绿体基因组、尤其是后者，若能提取纯净DNA，则可直接从 酶切后的电泳图谱看出其多态性，利用这一方法可以测定种群内、种群 间不同水平的物种在污染环境下抗性分化进化水平上的差异。 RFLP技术在用于基因型分型研究的同时，同样的可用于在不同环境 中微生物多样性的研究。
rflp技术原理
rflp技术原理今天咱们来唠唠一个超酷的技术——RFLP技术。
这名字听起来是不是有点神秘兮兮的？其实呀，它的原理就像一场有趣的基因小魔术呢！RFLP，全称限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）。
那啥是限制性片段呢？这就得先从限制酶说起啦。
限制酶就像一把超级小剪刀，不过这把剪刀可挑剔得很呢！它只在特定的DNA序列位置下剪子。
比如说，有一种限制酶就专门找“GAATTC”这个小密码，一看到这个序列，咔嚓，就把DNA链给剪断啦。
不同的限制酶有不同的识别序列，就像每个小剪刀都有自己专属的裁剪图案一样。
那这个和基因的多态性又有啥关系呢？咱都知道，基因就像一本超级复杂的生命之书，每个人的这本“书”虽然大致内容相似，但还是有很多小差别。
这些差别就体现在DNA序列上啦。
比如说，在某个特定的区域，你的DNA可能是一种序列，我的可能就稍微有点不一样。
当我们用同一种限制酶去剪我们的DNA的时候，因为序列的不同，剪出来的片段大小就不一样喽。
这就像是用同样的模具去切割不同形状的小饼干，最后得到的饼干块大小肯定不同呀。
想象一下，我们有一段长长的DNA链，就像一条长长的彩色绳子。
如果这个绳子上有好几个限制酶的识别位点，那限制酶就会在这些位点把绳子剪断。
如果两个人的这段DNA绳子在某些位点的序列不一样，那么限制酶剪出来的小片段长度就会有差异。
这种差异就是RFLP所说的多态性啦。
那我们怎么能看到这些片段长度的不同呢？这就用到了电泳技术。
电泳就像是一场DNA片段的赛跑比赛。
我们把这些被限制酶剪断的DNA片段放在一个特殊的凝胶里面，然后通上电。
DNA片段都是带负电的小粒子，在电场的作用下，它们就会朝着正极跑。
但是呢，因为片段大小不一样，小的片段跑起来就轻快，像个小瘦子，很快就跑到前面去了；大的片段就像个小胖子，跑得慢腾腾的。
这样，在凝胶上就会形成不同的条带，就像一个个小梯子一样。
rflp标记的名词解释
rflp标记的名词解释RFLP是"Restriction Fragment Length Polymorphism"（限制性片段长度多态性）的缩写，是一种基因分型技术，用于研究DNA序列的差异性。
通过观察DNA片段的长度变化，RFLP可以帮助人们了解基因座在个体之间的多态性，从而提供了一种分子遗传分析的方法。
一、RFLP的原理RFLP技术基于DNA序列的变异，而DNA的变异表现为序列中的一处或多处核苷酸序列发生突变。
这些变异会导致限制性内切酶切割DNA序列时产生不同的片段长度。
通过将DNA进行限制性内切酶消化，再通过凝胶电泳技术分离DNA片段，并通过特定的探针杂交以检测特定的片段，就可以确定个体之间的差异。
二、RFLP技术的应用1. 生物学研究：RFLP技术被广泛应用于生物学研究中，特别是用于研究种群遗传学、亲子关系以及进化等方面。
通过分析特定基因座的RFLP分型，可以推测个体或群体之间的亲缘关系、种群的遗传多样性以及基因座的分布情况，为生物学研究提供了宝贵的遗传数据。
2. 遗传疾病检测：RFLP技术在遗传疾病的检测与诊断中也有重要的应用。
许多遗传疾病与特定的基因突变有关，通过分析这些突变引起的RFLP变异，可以确定某些疾病的患病风险。
例如，围绝经期乳腺癌与BRCA1基因的RFLP分型相关，通过进行RFLP分析，可以预测遗传性乳腺癌的风险。
三、RFLP的优缺点1. 优点：RFLP技术在技术成熟的同时，具有高度可靠性和准确性。
通过分析特定基因座的RFLP分型，可以得出有关个体间遗传关系、多态性以及基因特征等信息。
此外，RFLP技术还具有较高的灵敏度，能够检测到充分稀释的DNA样本。
2. 缺点：然而，RFLP技术也存在一些局限性。
首先，该技术要求大量的DNA 样本，通常需要提取和纯化大量高质量的DNA，这在某些情况下可能是困难的。
此外，从样本收集到结果分析需要较长的时间，限制了该技术应用于实时或紧急情况的能力。
RFLP,RAPD,ALFP,SSR的原理及示意图
1.RFLP限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。
技术路线：缺点：RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制RFLP原理图示：2.RAPD原理：RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。
由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。
单一引物与反向重复序列结合。
使重复序列之间的区域得以扩增。
引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。
原理示意图：若位点2处碱基发生改变，则技术路线：RAPD的缺点：RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。
用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离3.AFLP原理：AFLP的全称是扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism）,此技术是建立在基因组限制性片段基础上的PCR 扩增。
RFLP技术
RFLP标记 标记
• 缺点： 缺点： • RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大， 且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依 赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP 分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高， 所以其应用受到了一定的限制。
RFLP标记 标记
• 优点： 优点： • 第一，较高可靠性，这是由限制性内切酶识别序列的专一 性决定； • 第二，来源于自然变异，依据DNA上丰富的碱基变异不需 任何诱变剂处理； • 第三，多样性，通过酶切反应来反映DNA水平上所有差异， 因而在数量上无任何限制； • 第四，共显性，指RFLP能够区别杂合体与纯合体；
RFLP标记 标记
RFLP标记 标记
• 根据RFLP产生的原因, 可将RFLP分为三种类型： 单碱基突变型。 ①单碱基突变型。由于在限制性内切酶识别位点 上发生了单个碱基替换。从而使这一限制性位点 丢失或获得所产生的多态性，也称为点多态性。 结构重排型。 ②结构重排型。由DNA序列发生突变(包括缺失、 重复、易位和插人等,其中有些突变与转座子有关) 和近年发现的高变区(HVR)所引起, 其特征是限制 性内切酶识别位点本身的碱基未发生改变, 改变的 是它的相对位置。③甲基化类型发生改变 ③甲基化类型发生改变。如 Muller(1990)发现水稻再生植株中的一些(RFLP) 即由限制性位点的碱基甲基化类型发生改变所造 成
简单介绍RFLP分度的多样性（RFLP）是发展最早的分子标 记技术。是基于分子杂交技术的分子标记。 • 基本原理 基本原理：限制性内切酶识别双链DNA分子的特定序列, 并在特定位点将DNA切开, 形成长度不等的限制片段。不 同个体间DNA的核苷酸顺序变化就意味着各自DNA的特异 性切点分布不同, 从而经限制性内切酶酶解后产生不同的 限制片段。当这些大小不等的片段通过凝胶电泳时就形成 不同的带, 用分子探针杂交并利用放射自显影在感光底片 上成像, 就会找出不同的位置（如图1）。所以, RFLP指的 指的 是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后, 含同源序 是用限制性内切酶切割不同个体基因组 后 列的酶切片段在长度大小或数目上的差异。 列的酶切片段在长度大小或数目上的差异。
rflp技术的原理与应用
RFLP技术的原理与应用1. 前言RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）技术是一种分子生物学的重要工具，广泛应用于基因组研究、遗传检测、克隆筛选等领域。
本文将介绍RFLP技术的原理以及其在科研和医学领域中的应用。
2. RFLP技术的原理RFLP技术基于DNA的核酸序列变异情况，利用限制酶切酶对DNA进行切割，然后通过电泳技术对DNA片段进行分离和检测。
RFLP技术的基本步骤如下：•DNA样品的制备：从细胞或组织中提取DNA样品，并经过适当的纯化和浓缩处理。
•限制酶切：将提取的DNA样品与适当的限制酶切酶一起反应，使DNA在特定的位点发生切割。
这些限制酶切位点是由DNA序列中的特定核苷酸序列决定的。
•电泳分离：将经过限制酶切的DNA片段在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
由于DNA片段的长度不同，电泳后会在凝胶上形成不同的带状图案。
•DNA杂交：将电泳分离后的DNA片段转移到膜上，并与与之互补的标记探针进行杂交。
这些探针通常是放射性同位素或荧光标记的DNA分子，能够与目标片段进行特异性结合。
•探针检测：利用放射性测量或荧光成像技术来检测杂交的DNA片段，得到特定的带状图案。
3. RFLP技术的应用3.1 遗传疾病的诊断与筛查RFLP技术可以应用于遗传疾病的诊断与筛查。
在某些遗传病例中，特定的基因突变会导致限制酶切位点的改变，从而使得RFLP图谱发生明显变化。
通过对患者和正常人进行DNA样品的限制酶切与电泳分离，可以检测出这些差异，并进行病例的判定。
3.2 疾病易感性的研究RFLP技术可以用于研究不同个体间基因的差异，从而探究疾病易感性的相关基因。
通过在群体中比较RFLP图谱的差异，可以寻找和疾病易感性相关的基因座以及致病突变。
这对于进一步阐明疾病发病机制、预测风险以及开发个体化治疗手段具有重要意义。
3.3 基因克隆和转基因研究RFLP技术在基因克隆和转基因研究中也扮演着重要的角色。
rflp技术步骤
rflp技术步骤RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）技术是一种用于研究基因组中特定DNA序列差异的分子生物学技术。
以下是一般性的RFLP技术步骤：1. DNA提取：从感兴趣的生物体中提取总DNA。
这可以通过标准的DNA提取方法来完成。
2. DNA限制性酶切：将提取的DNA与一种或多种限制性酶一起处理。
限制性酶是能够识别并切割DNA的特定序列的酶。
这个步骤会在DNA的特定位置产生切口，形成DNA片段。
3. 电泳分离：将经过酶切的DNA样品加载到聚丙烯酰胺凝胶电泳板上，并通过电泳进行分离。
由于DNA片段的大小不同，它们在电场中移动的速度也不同，从而分离开来。
4. 转移和固定：将凝胶上的DNA片段转移到支持膜（通常是尼龙膜）。
这个过程被称为Southern blotting。
然后，DNA片段被固定在膜上，形成一个镜像。
5. 探针的制备：准备一个标记的DNA或RNA探针，这个探针与你感兴趣的DNA序列有亲和性。
探针通常标记有放射性同位素或荧光染料，以便检测。
6. 探针杂交：将标记的探针与转移和固定的DNA片段进行杂交。
探针与样品中的相应DNA序列结合，形成探针-目标DNA杂交。
7. 洗脱：清洗掉未与探针结合的DNA，以减少背景信号。
8. 检测和分析：通过放射性探针或荧光染料的辐射或发光来检测与探针结合的DNA片段。
这可以通过放射性底片、荧光成像或其他检测方法完成。
9. 数据解读：分析和解释RFLP模式，识别不同个体之间的DNA片段长度差异，从而得出关于基因型和基因型频率的信息。
RFLP技术主要用于研究DNA序列的差异，包括遗传变异、基因型的分析以及种群遗传学研究。
它在分子生物学和遗传学领域有着广泛的应用。
RFLP,SNP标记
RFLP的操作流程
RFLP具有以下特点：
RFLP遍布低拷贝编码序列，并且非常稳定，但 RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂， 不适于大规模的分子育种。 可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的， 也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是 由碱基突变或倒位、 还是由缺用
SNP标记技术，主要包括两个方面：SNP位点 的发现和SNP分型。 发现SNPs方法:包括直接测SNPs。 通常从待测定 的基因或ESTs提供的序列设计引物，扩增出目 的片段，对扩增产物进行双链测序。然后，还 要对所得序列进行排序并仔细鉴别真正的多态 性和由于测序误差而产生的差异。也可以通过 生物信息学相关软件查找预测SNP。
（三）分子信标技术 与Taqman技术相 似，分子信标技术也是在PCR反应体系种 加入荧光标记的探针与靶序列杂交，通过 仪器检测荧光值的变化，进行基因分型。 （四）焦磷酸测序法 焦磷酸测序法 是一种不依赖平板胶或毛细管电泳，不依 赖DNA的荧光标记/激发/检测体系的序列 分析技术，适用于已知SNP的序列验证及 基因分型。
优点：（1）SNP具有共显性，能获得的 标记数量多，易于实现高通量。 （2）SNP是基因组中最简单、最常见的 多态性形式，具有很高的遗传稳定性。 缺点:芯片设计成本高，由于DNA样品的 复杂性，有些SNP不能被捡起。
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SNP标记
基于DNA芯片技术的分子标记技术 核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是美国学者 Lander E于1996年提出的第三代DNA遗 传标记。由于单个核苷酸改变而导致核酸 序列多态，即基因中的点突变。SNP 标 记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。 人类基因组大约每 1250 bp SNP 出现一 次，已有2000多个标记定位于人类染色 体，对人类基因组学研究具有重要意义。 检测 SNP 的最佳方法是 DNA 芯片技术。
rflp的具体流程
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RFLP技术
遗传分析的根本方法是DNA水平的分析，可分为两种方法：直接对DNA全部碱基序列的分析和DNA部分碱基序列的分析。
从原理上可分为两类：直接测序，主要是分析一些特定基因或DNA片段的核苷酸序列；另一类是检测基因组的一批识别位点，如限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）分析，DNA指纹分析和随机扩增多态DNA（Random Amplified Polymophism DNA）技术等
RFLP技术是用特定的方法将核（n）DNA,叶绿体（cp）DNA,线粒体（mt）DNA或总DNA，cDNA（用特定基因克隆片段作为探针来检测生物基因组），MHC（主要相容性复合体）提取出来，用限制性内切酶消化后，直接或间接地得出酶切片段在长度和数量上的差异。
限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）是指用限制性内切酶消化不同基因型的DNA后产生的酶切片段在长度和数量上的差异。
它的分子基础是核苷酸序列出现碱基代替或插入／缺失及倒位分子重排事件，而导致限制性切点或获得。
在遗传多态性研究中，常用于RFLP 分析的DNA分子主要有：cpDNA、mtDNA、Rdna，单拷贝基因以及变相基因等。
方法是将上述DNA之一，用限制性酶切消化，电泳印迹，再用DNA探针杂交，从而得到与探针同源的DNA序列酶切后在长度上的差异。
对于特定基因和DNA片段而言，还可采用PCR技术将目的DNA扩增至百万倍后直接酶切观察，使方法更为简便，节省和安全。
随机扩增多态DNA（Random Amplified Polymophism DNA，RAPD）技术是1990年出现的一项新技术，该技术通过PCR进行DNA扩增，所用引物是G＋C含量为50～70％的单个随机引物，这些引物在一定的退火条件下能与基因组DNA的互补序列配对，启动DNA的合成。
该技术具有以下特点：（1）无需预先知道受试有机体基因组的序列，因而能用于所有的生物体；（2）绝大多数标记为孟德尔遗传；（3）能迅速提供重建系统发育史所有的大量的遗传标志；（4）只需极少的基因组，无需借助于有伤害的同位素；（5）耗费的人力物力少。
RFLP即限制性片段多态性分析，是ሆሆሆῗอ㚄重要技术。
随着PCR技术的发展，目前在特定物种材料的研究中出现了基于PCR技术上的RFLP技术，与传统的RFLP技术相比，PCR－RFLP具有无需标志，灵敏度高，成本低，可重复性强的特点。
该技术是建立于生物体的某些基因两端具有高度保守性而中间部分为高度可变性区，利用两端的保守区为引物，可扩增出特异片段，这些片段的中间部分存在不同序列，因此用一定的限制性内切酶处理这些片段，经电泳分析可得不同的酶切图谱，表现出RFLP的特征。
利用这种酶切图谱可定性鉴定某一基因，如利用该方法可在不同微生物菌株中寻找Bt杀虫基因，也可用于鉴定白血病N－ras突变基因。
这种方法给研究人员提高了仅需要1～2对通用即鉴定出一个类群的已知基因，又能鉴定未知基因，从而为已知基因的鉴定和未知基因的发现提高有效
手段。
仪器及试剂：同酶切及RT－PCR试验
操作：
1：PCR操作
Buffer 10ul
6ul
20mM MgCl
2
10mM dNTP 2ul
10mM Primer3’和5’各2ul
DNA模板 0.1～2ng
Taq 酶 5u
加水至100ul 混匀，加50ul矿物油
94o C 1分钟； 50 o C 1分钟； 72 o C 30秒 32循环延伸15分钟 2：电泳检测扩增反应产物。
3：氯仿抽提，乙醇沉淀。
4：酶切 20 ul 反应体系，37 o C 1小时
5：电泳分析。
RAPD技术
RAPD技术操作：
1：仪器
PCR仪离心机取液器电泳仪电泳槽紫外观测仪
2：试剂：RAPD试剂盒
随机引物 taq酶 d NTP Taq酶缓冲液无菌水石腊油电泳试剂
3：操作：
1）基因组DNA提取见试验一
2）取0.5mlEpppondef 管，加入Taq酶缓冲液，100uM的d NTP，引物15ng，基因组模板DNA20ng ,0.75单位的taq酶，加水至20 ul，再加入30 ul石腊油，离心后，进行PCR 扩增。
PCR扩增参数：
94o C变形 15秒
36o C 退火 30秒
72o C 延伸 45秒
46个循环，结束后，72o C延时4分钟
3）扩增产物与电泳上样液混匀，1.5％Agrose胶电泳分析。