第四章 蛋白质的分离纯化
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(S)
沉源自文库速度法/差速离心
如果两种蛋白质的沉降系数相差一个数量级以上， 可用差速离心，反复多次达到分离效果。
原理：开始在一个较低的速度下离心，使沉降系 数大的物质沉淀，其他物质仍保留在溶液中。 取上清，在更大的离心场中再离心，又会获得 一些沉淀物质，如此反复多次，便可使混合物 逐级被分开。（P41）
第一节 蛋白质的理化性质
一、蛋白质的两性解离
二、蛋白质的胶体性质
三、蛋白质的变性、沉淀和凝固
四、蛋白质的紫外吸收
五、蛋白质的呈色反应
一、蛋白质的两性解离
蛋白质分子除了两端的游离氨基和羧基可以解离 外，侧链中某些基团在一定的溶液pH条件下都可 解离成带负电荷或正电荷的基团。 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、 负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为 零 ， 此 时 溶 液 的 pH 值 称 为 蛋 白 质 的 等 电 点 （isoelectric point，pI）。 当蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质带负 电荷，反之则带正电荷。
3. 有机溶剂沉淀法
原理：加入能与水混溶的有机溶剂，减少了水 与蛋白质间的作用力，使蛋白质脱水；而且有 机溶剂的加入降低了溶液的介电常数，增强了 蛋白质分子间的作用力，使蛋白质分子易于凝 聚沉淀。（P39） 加入有机溶剂沉淀蛋白质是粗提蛋白质常用的 方法之一。（P39）
沉降平衡法/密度梯度离心
如果两种蛋白质的沉降系数相差不到一个数量 级，用差速离心很难奏效，若改用密度梯度 离心，便可获得比较满意的分离效果。 原理：在离心管中造成一个梯度密度环境，使 介质的最大密度大于分离物的最大密度。而 后加入待分离物，在离心力的作用下，当分 离物的密度与介质密度相等时，分离物即停 留在与其密度相同的区域，从而达到分离目 的。（P41）
注意：生物学活性的丧失并不一定完全是 变性的结果，如蛋白质肽链水解断裂、去 除辅基和应用抑制剂等，均可导致蛋白质 失活。
不可逆变性：大多数蛋白质变性时其空间结构 破坏严重，不能恢复。 可逆变性：有些蛋白质在变性后，除去变性因 素仍可恢复其活性。 蛋白质的复性（renaturation）：若蛋白质变性 程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可 恢复或部分恢复其原来的构象和功能。
硫酸铵的“分馏”
逐级按递增的比例将硫酸铵加入到提取液中，其
间插入离心步骤。 硫酸铵要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤 其到接近计划饱和度时，加入的速度更要慢一些， 以免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质 沉淀。
硫酸铵沉淀用表
盐析时应注意的几个问题
① 盐的饱和度。不同蛋白质的盐析对盐的饱和度 要求不同。 ② pH。盐析时pH常选择在被分离的蛋白质等电点 附近。 ③ 蛋白质浓度。在相同盐析条件下，蛋白质浓度 越大越易沉淀；浓度过高也容易引起其他杂质 蛋白的共沉作用。因此，要选择适当浓度。 ④ 温度。浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析 操作一般可在室温下进行。对热特别敏感的蛋 白质，宜维持低温条件。 ⑤ 脱盐。
蛋白质的电荷
人体内各种蛋白质的等电点不同，但大 多数接近于pH5.0。
碱性蛋白质：鱼精蛋白和组蛋白等。 酸性蛋白质：胃蛋白酶和丝蛋白等。
二、蛋白质的胶体性质
蛋白质在溶液中形成的颗粒直径大约1～100 nm，属于胶体颗粒的范围，所以蛋白质是胶 体物质，蛋白质的水溶液是亲水胶体溶液。 蛋白质形成亲水胶体溶液的稳定因素：分子 表面的水化层和电荷层。 在蛋白质表面有不少的亲水基团，能与水发 生水合作用。水分子受蛋白质极性基团的影 响，定向排列在蛋白质分子的周围，形成水 化层，蛋白质颗粒不致相聚而沉淀。
蛋白质在偏离等电点的溶液中，形成电荷 层，同性电荷相斥，防止蛋白质颗粒相聚 沉淀。
蛋白质的水溶液是稳定的亲水胶体溶液。 溶液扩散慢，粘度大，不能透过半透膜。
三、蛋白质的变性、沉淀和凝固
蛋白质的变性（denaturation）：在某些 物理或化学因素作用下，蛋白质的空间 构象破坏（不包括肽链的断裂等一级结 构变化），导致蛋白质若干理化性质和 生物学活性的改变。
例如，核糖核酸酶经β-巯基乙醇和 尿素作用后，发生变性，失去生 物学活性。变性后如经过透析去 除尿素和β-巯基乙醇，又可恢复 其酶活性。
蛋白质的复性
蛋白质的沉淀
蛋白质的沉淀（precipitation）：蛋白质分 子凝聚而从溶液中析出的现象。 蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链相 互缠绕，继而聚集，因而从溶液中析出，产 生沉淀。 变性的蛋白质易于沉淀；有时蛋白质发生沉 淀，但并不变性。
3. 米伦反应(millon reaction)
蛋白质溶液中加入米伦试剂（亚硝酸汞、 硝酸汞及硝酸的混和液），蛋白质首先 沉淀，加热则变为红色沉淀，此为酪氨 酸的酚核所特有的反应，因此含有酪氨 酸的蛋白质均呈米伦反应。
第二节 分离纯化蛋白质样品的方法（P87）
蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构、化学组成 和生物功能的基础。
Caesium chloride densitiy gradient centrifugation
二、沉淀法
基本原理：根据不同物质在溶剂中
的溶解度不同而达到分离的目的。 溶解度的大小与溶质和溶剂的化
学性质及结构有关。
常用的沉淀方法
1. 等电点沉淀法 2. 盐析沉淀法 3. 有机溶剂沉淀法
4. 蛋白质沉淀剂
蛋白质变性的因素
1. 物理因素
高温、高压、紫外线、X线照射、超 声波、剧烈震荡和剧烈搅拌等。 2. 化学因素 强酸、强碱、重金属盐、有机溶剂、 尿素和十二烷基磺酸钠（SDS）等。
蛋白质变性后的改变
溶解度降低（球状蛋白质）；结晶体消失； 黏度增加；呈色性增加；易被蛋白水解酶 水解；生物学功能丧失。
目前，蛋白质的分离纯化技术的发展趋向于精细 而多样化技术的综合运用，但基本原理均是以蛋 白质的性质为依据的。实际工作中应按不同的要 求和条件选用不同的方法。
一、离心法 二、沉淀法 三、透析法
四、过滤法
五、电泳法
六、层析法
一、离心法
原理：分子在溶液中能够运动和扩散，同时 受重力场的作用还有沉降的趋势。分子越 大，扩散越慢而沉降越快；分子越小，扩 散越快而沉降越慢，甚至不能自然沉降。 因此，借助离心力场，根据分子不同的大 小、形状和质量在离心场中表现出不同的 行为而达到相互分离的目的。
变性蛋白质的结絮作用
变性蛋白质的结絮作用（flocculation）： 蛋白质被强酸或强碱变性后，仍能溶于强 酸或强碱溶液中，若将此强酸或强碱溶液 的pH调至等电点，则变性蛋白质立即结成 絮状的不溶解物，所生成的絮状物仍能再 溶于强酸或强碱中。
蛋白质的凝固
（protein coagulation）
蛋白质分子质量小于106者，用离心效果不好， 应改用其他分离方法。
离心机转数与离心力的换算
rpm(revolution per minute)：离心机每分 钟的转数。 RCF(relative centrifugal field)：相对离心 场，以重力加速度g的倍数来表示。 RCF；rpm；r（以cm表示）：离心机转轴 中心与离心套管底部内壁的距离； RCF=1.119×10-5×r×（rpm）2
常用的中性盐
①
② ③ ④ ⑤ ⑥ 硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠和磷酸钠等。 使用硫酸铵的突出优点： 溶解度大且不易受温度影响，尤其是在低温时仍有 相当高的溶解度。 分离效果好，有的提取液加入适量的硫酸铵进行盐 析，一步就可以除去75％的杂质，纯度提高了4倍。 不易引起变性，有稳定蛋白质结构的作用。 pH范围广，溶解时散热少。 价格便宜，不污染环境。 一定浓度的硫酸铵还可以抑制细菌的生长。
盐溶：由于加入中性盐而使蛋白质溶解度增加 的现象。（P39）
盐析：在蛋白质溶液中加入大量的中 性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其 析出。（P39） 盐析沉淀法的原理：中性盐的亲水性 大于蛋白质分子的亲水性，所以加入大 量中性盐后，破坏了蛋白质分子的水膜， 暴露出疏水区域；同时又中和了电荷， 破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉 淀。
① ②
③
④
离心手段：离心机。 离心机（按转速分） 普通型离心机（500-4000 r/min）：蛋白质分 子质量大于108 Da， 高速型离心机（8000-25000 r/min）：蛋白质 分子质量大于108 Da ， 超速型离心机（25000-80000 r/min）：蛋白质 分子质量在106-108 Da ， 超高速型离心机（150000 r/min）：蛋白质分 子质量在106-108 Da 。
五、蛋白质的呈色反应
1. 茚三酮反应(ninhydrin reaction)
蛋白质经水解后产生的氨基酸可发生茚三酮反应。 原理：还原型的茚三酮可与氨基酸加热分解产生的氨 结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色的化合 物。此化合物的最大吸收峰在570 nm波长处。由于 此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比， 因此可作为氨基酸定量分析方法。
蛋白质的凝固：蛋白质变性后的絮状物加热变为比 较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸或强碱中。 例如，鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清变成固体状。 凝固是蛋白质变性后进一步发展的一种结果。
四、蛋白质的紫外吸收
蛋白质分子中含有共轭双键的氨基酸（如 Tyr、Phe和Trp），因此，在280 nm波长 处有特征性吸收峰。在此波长范围内，蛋 白质的OD280 值与其浓度呈正比关系。可 做蛋白质定量测定。
第四章 蛋白质的分离纯化
蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，其 理化性质一部分与氨基酸相同或相似， 如两性电离、等电点、紫外吸收性质和 呈色反应等；也有一部分又不同于氨基 酸，如高分子量、胶体性质、沉淀、变 性和凝固等特点。
第一节 蛋白质的理化性质 第二节 分离纯化蛋白质样品的方法（P87） 第三节 蛋白质样品的储存与运输（P91） 第四节 电泳技术 第五节 层析技术
1. 等电点沉淀法
原理：利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而 各种蛋白质由于具有不同的等电点来分离蛋白 质的方法。 溶液的pH可以通过影响蛋白质分子的解离状态， 即带电状况而影响和改变其溶解度。可以通过 改变溶液的pH，使要分离的蛋白质大部分或全 部沉淀下来，而其他蛋白质仍留在溶液中，达 到粗分蛋白质组分的目的。（P39） 这样分离的蛋白质仍能保持其天然的生物学活 性。（P39）
2. 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子在碱性溶液中与硫酸铜共 热，呈现紫色或红色，称为双缩脲反应。 凡分子中含有两个以上－CO－NH－键的化 合物都呈此反应。蛋白质和多肽中均有肽键， 故都具有这一呈色反应。 因为氨基酸无此反应，当蛋白质溶液中蛋白 质的水解不断加强时，氨基酸浓度上升，其 双缩脲呈色的深度就逐渐下降。双缩脲反应 可检测蛋白质的水解程度。
不同的蛋白质分子发生盐析所要求的盐 离子的浓度不同。可以通过在蛋白质溶 液中加入不同量的中性盐，使要分离的 蛋白质与杂质分离开来。（P39） 和蛋白质一起盐析出的中性盐可以用透 析或凝胶过滤的方法除去。（P39）
盐析沉淀是可逆的，它一般不会 破坏蛋白质的生物活性。
盐析沉淀是一种简单温和的分离 方法，适用于蛋白质的前期分离 和后期浓缩。
密度剃度离心时，离心管中的介质是不均一的， 从近中心到远中心密度不断增加，形成梯度。 常用的梯度介质有甘油、蔗糖、溴化钾、氯化铯。 注意： ① 选用介质要注意浮力密度范围，被分离的蛋白质 密度不能大于介质的最大密度； ② 所选介质不能影响蛋白质的活性，不腐蚀转头和 离心管； ③ 价格要低廉，回收要方便等。
注意： 在等电点时，各种蛋白质仍有一定的
溶解度而使沉淀不完全，同时许多蛋白质的等 电点十分接近。因此，单独使用此法分辨率较
低，实际工作中此法常与盐析沉淀法、有机溶
剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高
沉淀能力和分离效果。
2. 盐析沉淀法
盐离子对蛋白质溶解度的影响随其浓度不同而 不同。（P39） 在低盐浓度的蛋白质溶液中，静电作用使蛋白 质分子外围聚集了一些带相反电荷的离子，加 强了蛋白质和水的作用，增加了蛋白质的溶解 度。（P39）
沉源自文库速度法/差速离心
如果两种蛋白质的沉降系数相差一个数量级以上， 可用差速离心，反复多次达到分离效果。
原理：开始在一个较低的速度下离心，使沉降系 数大的物质沉淀，其他物质仍保留在溶液中。 取上清，在更大的离心场中再离心，又会获得 一些沉淀物质，如此反复多次，便可使混合物 逐级被分开。（P41）
第一节 蛋白质的理化性质
一、蛋白质的两性解离
二、蛋白质的胶体性质
三、蛋白质的变性、沉淀和凝固
四、蛋白质的紫外吸收
五、蛋白质的呈色反应
一、蛋白质的两性解离
蛋白质分子除了两端的游离氨基和羧基可以解离 外，侧链中某些基团在一定的溶液pH条件下都可 解离成带负电荷或正电荷的基团。 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、 负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为 零 ， 此 时 溶 液 的 pH 值 称 为 蛋 白 质 的 等 电 点 （isoelectric point，pI）。 当蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质带负 电荷，反之则带正电荷。
3. 有机溶剂沉淀法
原理：加入能与水混溶的有机溶剂，减少了水 与蛋白质间的作用力，使蛋白质脱水；而且有 机溶剂的加入降低了溶液的介电常数，增强了 蛋白质分子间的作用力，使蛋白质分子易于凝 聚沉淀。（P39） 加入有机溶剂沉淀蛋白质是粗提蛋白质常用的 方法之一。（P39）
沉降平衡法/密度梯度离心
如果两种蛋白质的沉降系数相差不到一个数量 级，用差速离心很难奏效，若改用密度梯度 离心，便可获得比较满意的分离效果。 原理：在离心管中造成一个梯度密度环境，使 介质的最大密度大于分离物的最大密度。而 后加入待分离物，在离心力的作用下，当分 离物的密度与介质密度相等时，分离物即停 留在与其密度相同的区域，从而达到分离目 的。（P41）
注意：生物学活性的丧失并不一定完全是 变性的结果，如蛋白质肽链水解断裂、去 除辅基和应用抑制剂等，均可导致蛋白质 失活。
不可逆变性：大多数蛋白质变性时其空间结构 破坏严重，不能恢复。 可逆变性：有些蛋白质在变性后，除去变性因 素仍可恢复其活性。 蛋白质的复性（renaturation）：若蛋白质变性 程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可 恢复或部分恢复其原来的构象和功能。
硫酸铵的“分馏”
逐级按递增的比例将硫酸铵加入到提取液中，其
间插入离心步骤。 硫酸铵要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤 其到接近计划饱和度时，加入的速度更要慢一些， 以免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质 沉淀。
硫酸铵沉淀用表
盐析时应注意的几个问题
① 盐的饱和度。不同蛋白质的盐析对盐的饱和度 要求不同。 ② pH。盐析时pH常选择在被分离的蛋白质等电点 附近。 ③ 蛋白质浓度。在相同盐析条件下，蛋白质浓度 越大越易沉淀；浓度过高也容易引起其他杂质 蛋白的共沉作用。因此，要选择适当浓度。 ④ 温度。浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析 操作一般可在室温下进行。对热特别敏感的蛋 白质，宜维持低温条件。 ⑤ 脱盐。
蛋白质的电荷
人体内各种蛋白质的等电点不同，但大 多数接近于pH5.0。
碱性蛋白质：鱼精蛋白和组蛋白等。 酸性蛋白质：胃蛋白酶和丝蛋白等。
二、蛋白质的胶体性质
蛋白质在溶液中形成的颗粒直径大约1～100 nm，属于胶体颗粒的范围，所以蛋白质是胶 体物质，蛋白质的水溶液是亲水胶体溶液。 蛋白质形成亲水胶体溶液的稳定因素：分子 表面的水化层和电荷层。 在蛋白质表面有不少的亲水基团，能与水发 生水合作用。水分子受蛋白质极性基团的影 响，定向排列在蛋白质分子的周围，形成水 化层，蛋白质颗粒不致相聚而沉淀。
蛋白质在偏离等电点的溶液中，形成电荷 层，同性电荷相斥，防止蛋白质颗粒相聚 沉淀。
蛋白质的水溶液是稳定的亲水胶体溶液。 溶液扩散慢，粘度大，不能透过半透膜。
三、蛋白质的变性、沉淀和凝固
蛋白质的变性（denaturation）：在某些 物理或化学因素作用下，蛋白质的空间 构象破坏（不包括肽链的断裂等一级结 构变化），导致蛋白质若干理化性质和 生物学活性的改变。
例如，核糖核酸酶经β-巯基乙醇和 尿素作用后，发生变性，失去生 物学活性。变性后如经过透析去 除尿素和β-巯基乙醇，又可恢复 其酶活性。
蛋白质的复性
蛋白质的沉淀
蛋白质的沉淀（precipitation）：蛋白质分 子凝聚而从溶液中析出的现象。 蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链相 互缠绕，继而聚集，因而从溶液中析出，产 生沉淀。 变性的蛋白质易于沉淀；有时蛋白质发生沉 淀，但并不变性。
3. 米伦反应(millon reaction)
蛋白质溶液中加入米伦试剂（亚硝酸汞、 硝酸汞及硝酸的混和液），蛋白质首先 沉淀，加热则变为红色沉淀，此为酪氨 酸的酚核所特有的反应，因此含有酪氨 酸的蛋白质均呈米伦反应。
第二节 分离纯化蛋白质样品的方法（P87）
蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构、化学组成 和生物功能的基础。
Caesium chloride densitiy gradient centrifugation
二、沉淀法
基本原理：根据不同物质在溶剂中
的溶解度不同而达到分离的目的。 溶解度的大小与溶质和溶剂的化
学性质及结构有关。
常用的沉淀方法
1. 等电点沉淀法 2. 盐析沉淀法 3. 有机溶剂沉淀法
4. 蛋白质沉淀剂
蛋白质变性的因素
1. 物理因素
高温、高压、紫外线、X线照射、超 声波、剧烈震荡和剧烈搅拌等。 2. 化学因素 强酸、强碱、重金属盐、有机溶剂、 尿素和十二烷基磺酸钠（SDS）等。
蛋白质变性后的改变
溶解度降低（球状蛋白质）；结晶体消失； 黏度增加；呈色性增加；易被蛋白水解酶 水解；生物学功能丧失。
目前，蛋白质的分离纯化技术的发展趋向于精细 而多样化技术的综合运用，但基本原理均是以蛋 白质的性质为依据的。实际工作中应按不同的要 求和条件选用不同的方法。
一、离心法 二、沉淀法 三、透析法
四、过滤法
五、电泳法
六、层析法
一、离心法
原理：分子在溶液中能够运动和扩散，同时 受重力场的作用还有沉降的趋势。分子越 大，扩散越慢而沉降越快；分子越小，扩 散越快而沉降越慢，甚至不能自然沉降。 因此，借助离心力场，根据分子不同的大 小、形状和质量在离心场中表现出不同的 行为而达到相互分离的目的。
变性蛋白质的结絮作用
变性蛋白质的结絮作用（flocculation）： 蛋白质被强酸或强碱变性后，仍能溶于强 酸或强碱溶液中，若将此强酸或强碱溶液 的pH调至等电点，则变性蛋白质立即结成 絮状的不溶解物，所生成的絮状物仍能再 溶于强酸或强碱中。
蛋白质的凝固
（protein coagulation）
蛋白质分子质量小于106者，用离心效果不好， 应改用其他分离方法。
离心机转数与离心力的换算
rpm(revolution per minute)：离心机每分 钟的转数。 RCF(relative centrifugal field)：相对离心 场，以重力加速度g的倍数来表示。 RCF；rpm；r（以cm表示）：离心机转轴 中心与离心套管底部内壁的距离； RCF=1.119×10-5×r×（rpm）2
常用的中性盐
①
② ③ ④ ⑤ ⑥ 硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠和磷酸钠等。 使用硫酸铵的突出优点： 溶解度大且不易受温度影响，尤其是在低温时仍有 相当高的溶解度。 分离效果好，有的提取液加入适量的硫酸铵进行盐 析，一步就可以除去75％的杂质，纯度提高了4倍。 不易引起变性，有稳定蛋白质结构的作用。 pH范围广，溶解时散热少。 价格便宜，不污染环境。 一定浓度的硫酸铵还可以抑制细菌的生长。
盐溶：由于加入中性盐而使蛋白质溶解度增加 的现象。（P39）
盐析：在蛋白质溶液中加入大量的中 性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其 析出。（P39） 盐析沉淀法的原理：中性盐的亲水性 大于蛋白质分子的亲水性，所以加入大 量中性盐后，破坏了蛋白质分子的水膜， 暴露出疏水区域；同时又中和了电荷， 破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉 淀。
① ②
③
④
离心手段：离心机。 离心机（按转速分） 普通型离心机（500-4000 r/min）：蛋白质分 子质量大于108 Da， 高速型离心机（8000-25000 r/min）：蛋白质 分子质量大于108 Da ， 超速型离心机（25000-80000 r/min）：蛋白质 分子质量在106-108 Da ， 超高速型离心机（150000 r/min）：蛋白质分 子质量在106-108 Da 。
五、蛋白质的呈色反应
1. 茚三酮反应(ninhydrin reaction)
蛋白质经水解后产生的氨基酸可发生茚三酮反应。 原理：还原型的茚三酮可与氨基酸加热分解产生的氨 结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色的化合 物。此化合物的最大吸收峰在570 nm波长处。由于 此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比， 因此可作为氨基酸定量分析方法。
蛋白质的凝固：蛋白质变性后的絮状物加热变为比 较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸或强碱中。 例如，鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清变成固体状。 凝固是蛋白质变性后进一步发展的一种结果。
四、蛋白质的紫外吸收
蛋白质分子中含有共轭双键的氨基酸（如 Tyr、Phe和Trp），因此，在280 nm波长 处有特征性吸收峰。在此波长范围内，蛋 白质的OD280 值与其浓度呈正比关系。可 做蛋白质定量测定。
第四章 蛋白质的分离纯化
蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，其 理化性质一部分与氨基酸相同或相似， 如两性电离、等电点、紫外吸收性质和 呈色反应等；也有一部分又不同于氨基 酸，如高分子量、胶体性质、沉淀、变 性和凝固等特点。
第一节 蛋白质的理化性质 第二节 分离纯化蛋白质样品的方法（P87） 第三节 蛋白质样品的储存与运输（P91） 第四节 电泳技术 第五节 层析技术
1. 等电点沉淀法
原理：利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而 各种蛋白质由于具有不同的等电点来分离蛋白 质的方法。 溶液的pH可以通过影响蛋白质分子的解离状态， 即带电状况而影响和改变其溶解度。可以通过 改变溶液的pH，使要分离的蛋白质大部分或全 部沉淀下来，而其他蛋白质仍留在溶液中，达 到粗分蛋白质组分的目的。（P39） 这样分离的蛋白质仍能保持其天然的生物学活 性。（P39）
2. 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子在碱性溶液中与硫酸铜共 热，呈现紫色或红色，称为双缩脲反应。 凡分子中含有两个以上－CO－NH－键的化 合物都呈此反应。蛋白质和多肽中均有肽键， 故都具有这一呈色反应。 因为氨基酸无此反应，当蛋白质溶液中蛋白 质的水解不断加强时，氨基酸浓度上升，其 双缩脲呈色的深度就逐渐下降。双缩脲反应 可检测蛋白质的水解程度。
不同的蛋白质分子发生盐析所要求的盐 离子的浓度不同。可以通过在蛋白质溶 液中加入不同量的中性盐，使要分离的 蛋白质与杂质分离开来。（P39） 和蛋白质一起盐析出的中性盐可以用透 析或凝胶过滤的方法除去。（P39）
盐析沉淀是可逆的，它一般不会 破坏蛋白质的生物活性。
盐析沉淀是一种简单温和的分离 方法，适用于蛋白质的前期分离 和后期浓缩。
密度剃度离心时，离心管中的介质是不均一的， 从近中心到远中心密度不断增加，形成梯度。 常用的梯度介质有甘油、蔗糖、溴化钾、氯化铯。 注意： ① 选用介质要注意浮力密度范围，被分离的蛋白质 密度不能大于介质的最大密度； ② 所选介质不能影响蛋白质的活性，不腐蚀转头和 离心管； ③ 价格要低廉，回收要方便等。
注意： 在等电点时，各种蛋白质仍有一定的
溶解度而使沉淀不完全，同时许多蛋白质的等 电点十分接近。因此，单独使用此法分辨率较
低，实际工作中此法常与盐析沉淀法、有机溶
剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高
沉淀能力和分离效果。
2. 盐析沉淀法
盐离子对蛋白质溶解度的影响随其浓度不同而 不同。（P39） 在低盐浓度的蛋白质溶液中，静电作用使蛋白 质分子外围聚集了一些带相反电荷的离子，加 强了蛋白质和水的作用，增加了蛋白质的溶解 度。（P39）