bta-miR-1343-3p靶向NEDD8调控牛卵泡颗粒细

山西农业科学 2023，51（2）：198-205Journal of Shanxi Agricultural Sciences
bta-miR -1343-3p 靶向NEDD8调控牛卵泡颗粒
细胞增殖与凋亡机制初探
马晓燕，郭翔宇，贾凯琪，成
颖，吕丽华
（山西农业大学 动物科学学院，山西 太谷 030801）
摘
要：哺乳动物生殖过程中，颗粒细胞的增殖和凋亡在卵子发生、卵泡发育和卵泡闭锁中至关重要。

Mi‐
croRNA （miRNA ）是一种非编码的内源性小分子RNA ，主要在转录水平后调控细胞的各项生理活动。

由于miRNAs 存在的广泛性和多样性，以及一些miRNA 序列的保守性与同源性，提示了miRNA 可能承担着许多重要的生物学功能。

为探讨bta -miR -1343-3p 对牛卵泡颗粒细胞功能的影响及作用机制，研究采用牛卵泡颗粒细胞，利用生物信息学软件miRnada 和miRDB 进行靶基因bta -miR -1343-3p 结合位点的预测，采用双荧光素报告试验，验证了bta -miR -1343-3p 与NEDD8的靶标关系，通过利用bta -miR -1343-3p 模拟物（mimics ）和抑制物（inhibitors ）构建了卵泡颗粒细胞过表达和抑制模型，采用MTT 法检测转染模拟物与抑制物卵泡颗粒细胞的增殖情况，并且检测了相关基因表达量的变化。

结果显示，在牛卵泡颗粒细胞中过表达bta -miR -1343-3p 可抑制NEDD8基因的表达。

检测细胞增殖率结果发现，过表达bta -miR -1343-3p 可抑制卵泡颗粒细胞的增殖，并可促进卵泡颗粒细胞的凋亡；过表达bta -miR -1343-3p 后细胞周期相关基因CDK1、CDK4表达水平显著降低，而Bax 与Fas 基因表达量显著升高，表明bta -miR -1343-3p 靶向调控NEDD8基因影响牛卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡。

关键词：bta -miR -1343-3p ；卵泡颗粒细胞；卵泡发育；细胞周期；牛
中图分类号：S823 文献标识码：A 文章编号：1002‒2481（2023）02‒0198‒08
Preliminary Study on Mechanism of bta-miR-1343-3p Targeting NEDD8 Regulating Cell Proliferation and Apoptosis of Bovine Granulosa Cells
MA Xiaoyan ，GUO Xiangyu ，JIA Kaiqi ，CHENG Ying ，LÜ Lihua （College of Animal Science ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ）
Abstract ：In mammalian reproduction, granulosa cell proliferation and apoptosis are critical in oogenesis, folliculogenesis, and follicular atresia. Regulating various physiological activities of cells at the post -transcriptional level ，microRNA(miRNA) is an endogenous non -coding small RNA. Due to the extensiveness and diversity of miRNAs as well as the conservation and homology of some miRNA sequences, it is suggested that miRNAs may undertake many important biological functions. The aim of this study was to investigate the effect of bta -miR -1343-3p on the function of bovine granulosa cells and its action mechanisms, bovine follicular granulosa cells(GCs) were used, and the binding site of the target gene, bta -miR -1343-3p, was predicted by using bioinformatics software miRnada and miRDB, the dual fluorescent reporter assay was used to verify the target relationship between bta -miR -1343-3p and NEDD8. The bta -miR -1343-3p mimics and inhibitors were used to construct GCs overexpression and inhibition models. MTT assay was used to detect the effect of transfected miR -1343-3p mimics and inhibitors on the proliferation of GCs, and detect the changes in the expression of related genes. The results showed that overexpression of bta -miR -1343-3p in bovine GCs inhibited the expression of NEDD8 gene. Cell proliferation rate analysis showed that overexpression of bta -miR -1343-3p inhibited cell proliferation, but at the same time promoted the apoptosis of GCs. The expression levels of cell cycle related genes CDK1 and CDK4 were significantly decreased after overexpression of bta -miR -1343-3p, while the expression of Bax and Fas genes were significantly increased, indicating that bta -miR -1343-3p affected the proliferation and apoptosis of bovine follicular GCs by target regulating NEDD8 gene.
Key words ：bta -miR -1343-3p; granulosa cells(GCs); folliculogenesis; cell cycle; cattle
doi
doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.02.11收稿日期：2022-04-24
基金项目：山西省基础研究计划面上项目（20210302123393）；大同市重点研发计划项目（农业，2021027）作者简介：马晓燕（1995-），女，青海海东人，在读硕士，研究方向：动物遗传育种与繁殖。

通信作者：吕丽华（1969-），女，山西右玉人，教授，博士，主要从事动物生殖生理与繁殖生物技术研究工作。

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马晓燕等：bta-miR-1343-3p靶向NEDD8调控牛卵泡颗粒细胞增殖与凋亡机制初探
在哺乳动物生殖过程中，颗粒细胞的增殖和凋亡在卵子发生、卵泡发育和闭锁中起到至关重要的作用。

卵泡发育是一个有序复杂的过程，受到下丘脑-垂体-性腺轴的调控，并呈现周期性变化[1-2]。

生长卵泡发育至有腔卵泡之前不依赖促性腺激素，有腔卵泡的发育则依赖促性腺激素的作用，同时受到卵母细胞—颗粒细胞—膜细胞三者的协同调控[3]。

卵泡生长过程中卵母细胞以自分泌和旁分泌的方式与卵泡生态体系中的体细胞共同发挥作用，影响卵泡发育进程，并决定其最终命运。

颗粒细胞是卵泡体系中数量最多的体细胞，在卵泡发育过程中发挥了至关重要的作用[4]。

雌性哺乳动物从早期胚胎性腺发育到性成熟过程中，大量卵泡闭锁，调控卵泡闭锁的机制错综复杂，调控过程中的些许偏差都会导致卵泡发育阻滞和闭锁。

雌性哺乳动物在生命早期形成的卵巢储备是相对固定的，卵子储备量随着动物排卵而不断减少。

随着生存环境的改变，越来越多的哺乳动物包括人类都面临着由于卵泡生长调节异常导致的卵巢早衰致使生育年限缩短，因此，研究卵泡闭锁的发生机制将进一步解开卵泡闭锁的未解之谜。

目前，研究尚未揭开胚胎期卵泡闭锁的发生机制，而生长期卵泡闭锁的主要原因可归结为颗粒细胞过度凋亡[5-6]。

miRNA是一种内源的非编码小RNA，目前，在人类中已鉴定出数百种 miRNAs[7-8]。

由于这些miRNAs序列在不同哺乳动物间高度保守，因此，可推测哺乳动物体内绝大多数与发育和疾病相关的事件均与miRNAs的调控有关[9]。

成熟的miRNA可与其靶基因的3′UTR结合并发挥调控作用[9]，此外，miRNA可直接与蛋白质相互作用调控基因翻译过程[10]并影响表观遗传机制[11]，也可通过抑制DNA转录或破坏mRNA分子的稳定性实现对靶基因的负调控[12]。

哺乳动物中，30%以上的蛋白质编码基因受到miRNAs的调控[13]。

目前，在雌性哺乳动物生殖领域对miRNA的研究主要与卵泡发育有关，如颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌等方面。

TU等[14]研究发现，miRNAs在卵母细胞、颗粒细胞、膜细胞和卵泡液中广泛表达。

从原始卵泡形成，卵巢储备建立到初情期卵泡在促性腺激素作用下开始发育再到最终排卵，大量的miRNAs参与了上述过程[14-15]。

近年来研究发现，多种miRNAs参与了颗粒细胞调控。

ZHANG等[16]研究发现，miR-17-5p可通过靶向调控E2F转录因子１（Transcriptional factor，E2F1）可影响猪卵泡颗粒细胞的功能，在猪卵泡颗粒细胞中过表达miR-17-5p显著降低了转录因子E2F1的活性，促进了颗粒细胞生长和激素合成过程。

蒋秀敏等[17]研究发现，miR-483-5p可通过调控细胞外信号调节激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）的表达调控人卵泡颗粒细胞增殖和凋亡过程以及丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）在各种细胞反应中的作用[18]。

本研究基于前期在牛卵泡颗粒细胞中开展的全转录组测序结果，选择bta-miR-1343-3p为研究对象，进一步研究其在颗粒细胞增殖和凋亡中的调控作用，旨在初步揭示哺乳动物卵泡闭锁的调控机制。

1　材料和方法
1.1　试验材料
本研究所用的牛卵巢均来自山西省吕梁市文水县屠宰场，采集后采用75%酒精消毒并保存于4 ℃ DPBS中，2 h内运回实验室。

1.2　主要试剂
DMEM/F12基础培养基（HyClone公司，美国），胎牛血清（FBS）（赛澳美细胞（技术）有限公司，北京），无菌PBS缓冲液（博士德生物，武汉），MTT试剂盒（博士德生物，武汉），Lipofectamine 3000（Invitrogen公司，美国），E.Z.N.A.®Plasmid mini Kit I（Omega BioTek，美国），Mut Express II Fast Mutagenesis Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司，武汉），Dual-Luciferase Reporter Assay System （Promega Co. Ltd，美国），ClonExpress®Ultra One Step Cloning Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司，武汉），bta-miRNA-1343-3p模拟物与抑制物（汉恒
生物科技有限公司，上海），2×Es Taq Master Mix （Dye）（康为世纪生物科技有限公司，江苏）。

1.3　卵泡颗粒细胞的收集与培养
采用眼科剪分离卵巢皮质中的有腔卵泡。

将卵泡用眼科剪剪开，用细胞刮刀轻轻刮取卵泡内壁获取颗粒细胞并收集卵泡液，1 000 r/min下离心5 min，弃上清。

得到的细胞沉淀用新鲜无菌PBS 重悬，1 000 r/min下再离心3次，每次5 min，清洗沉淀中的血细胞等杂质。

清洗后的细胞沉淀用完全培养基（含10%的FBS和双抗）重悬，置于10 cm细胞培养皿中，37 ℃、5% CO2下培养24 h后观察细胞状态和密度，更换新的完全培养基，待细胞密度达到80%~90%时传代培养。

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1.4　靶基因预测
对高通量测序结果进行靶基因筛选分析，结合测序结果，进一步使用TargetScan（TargetscanHuman 7.1：predicted miRNA targets of miR-1343-3p）和miRanda（miRDB-miRNA Target Prediction Data‐base）筛选bta-miR-1343-3p的靶基因。

最终选择与卵泡颗粒细胞存活相关的基因NEDD8，使用RNA Hybird分析bta-miR-1343-3p与NEDD8基因UTR的结合位点。

1.5　NEDD8基因3'UTR双荧光素酶报告载体的构建
根据NCBI网站公布的牛NEDD8基因mRNA 序列，寻找NEDD8 3'UTR的靶点位置。

采用Primer 5.0设计NEDD8 3'UTR扩增引物，并在引物上下游加入酶切位点与双荧光素酶报告载体的同源序列。

进一步使用CE Design软件（南京诺唯赞生物科技有限公司）设计同源重组及突变引物序列，如表1所示。

颗粒细胞收集，RNA提取与反转录程序参考之前的研究[19]。

以牛卵泡颗粒细胞cDNA为模板，使用2×Es Taq Master Mix（Dye）扩增NEDD8基因3'UTR，具体步骤参考之前的研究[20]，PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的片段回收纯化后测序鉴定序列准确性。

将目的片段与线性化的pmir-GLO载体用同源重组酶连接，具体步骤按照ClonExpress®Ultra
One Step Cloning Kit说明书（南京诺唯赞生物科技有限公司，武汉）进行，重组产物转化感受态细胞。

经转化的感受态细胞短暂离心后涂布到LB固体培养基上（含氨苄青霉素），37 ℃过夜培养，挑取单个菌落摇菌测序。

将测序结果正确菌液进一步培养，使用E.Z.N.A.®Plasmid Mini Kit I提取质粒DNA，获得野生型重组质粒。

突变型双荧光素酶报告载体的构建采用Mut Express II Fast Mutagenesis Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司，武汉）进行3'UTR miRNA预测靶点的突变，以连接成功的野生型载体为模板，使用点突变引物引入报告载体序列突变。

突变质粒经PCR扩增，重组酶重组后转化感受态细胞，挑选单克隆菌株培养后测序，测序验证正确的菌液进一步培养质粒DNA，获得突变型质粒。

1.6　双荧光素酶活性检测
将293T细胞接种至24孔细胞培养板中，培养6~12 h，待细胞汇合度达到60%后转染。

试验组分为3组：（I）wt载体+mimics NC，wt载体+mimics；（II）mut载体+mimics NC，mut载体+mimics；（III）空载体+mimics NC，空载体+mimics。

将上述载体质粒800 ng和50 μm mimics使用Lipofectamine 3000共转染293T细胞，反应6 h后更换培养基，继续培养48 h，检测293T细胞的双荧光素酶活性。

转染48 h的293T细胞用无菌PBS清洗后加入100 μL 1×PLB，室温下裂解15 min，吸取20 μL 裂解液至96孔酶标板，加入100 μL LARⅡ后迅速在酶标仪中检测萤火虫荧光素酶活性，检测完毕后立即加入100 μL终止液，检测海肾荧光素酶的活性。

1.7　卵泡颗粒细胞中bta-miR-1343-3p mimics 和inhibitors的转染
将卵泡颗粒细胞均匀接种于12孔细胞培养板中，培养6~12 h，待细胞汇合度达到60%时采用Lipofectamine 3000转染bta-miR-1343-3p mimics 和inhibitors，6 h后更换完全培养基，继续培养48 h。

试验组与对照组详细引物序列如表2所示。

表1 bta-miR-1343-3p荧光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR of bta-miR-1343-3p
引物名称　Primers
3'UTR
UTR-mut
序列（5'—3'）　Sequences（5'-3'）
F: aacgagctcgctagcctcgagCGGACTCTGCTCCATTTTACCT R: cttgcatgcctgcaggtcgacAGGAGGTCAAGAAATATTTTATTGAGAA F: GAGGAtataattAGGCAGTGTTCCTGGCCCAA
R: TGCCTaattataTCCTCACAATCTCCCACCAACA
注：下划线为酶切位点。

Note： Underlined sequences were endonuclease.
表2 bta-miR-1343-3p 模拟物与抑制物序列
Tab.2 Sequences for bta-miR-1343-3p mimics and inhibitors
名称　Name
bta-miR-1343-3p 模拟物　bta-miR-1343-3p mimics
模拟物NC（cel-miR-67-3p）　Minics NC（cel-miR-67-3p）bta-miR-1343-3p抑制物　bta-miR-1343-3p inhibitor
抑制物NC（cel-miR-67-3p）　Inhibitor NC（cel-miR-67-3p）
序列（5'—3'）　Sequences（5'-3'）
CUCCUGGGGCCCGCACUCUC UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA GAGAGUGCGGGCCCCAGGAG UCUACUCUUUUCUAGGAGGUUGUGA
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马晓燕等：bta -miR -1343-3p 靶向NEDD8调控牛卵泡颗粒细胞增殖与凋亡机制初探
1.8　MTT 法检测颗粒细胞增殖率
将卵泡颗粒细胞均匀接种至96孔板，培养6~12 h 。

当细胞汇合度达60%时采用Lipofectamine 3000转染bta -miR -1343-3p mimics 和inhibitors ，继续培养24、48、72 h 后移除培养液。

每孔加90.0 μL 的新培养基和10 μL MTT ，37 ℃恒温培养箱内继续培养4 h ，再次移除培养液，加入110.0 μL 的Formazan 溶解液，避光孵育15 min ，490 nm 波长下测定吸光值。

1.9　qRT-PCR
使用Primer 5.0设计qRT -PCR 引物。

其中，
miRNA 下游引物为M5 miRNA qPCR Assay Kit 中自带引物，序列如表3所示。

mRNA 实时荧光定量流程按照TB Green TM Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒详细步骤进行。

miRNA 荧光定量使用M5 miRNA qPCR Assay Kit 进行，反应体系为：cDNA 1.0 μL ，M5 miRNA qPCR Mixture （2×）10.0 μL ，bta -miR -1343-3p Primer （10 μmol/L ）0.4 μL ，Reverse Primer （10 μmol/L ）0.4 μL ，加ddH 2O 20.0 μL 。

反应程序为：95 ℃ 10 min ；95 ℃ 15 s ，60 ℃ 1 min ，95 ℃ 15 s ，60.5 ℃ 1 min ，45个循环；95 ℃ 15 s 。

1.10　数据分析
miRNA 实时荧光定量数据的处理以U6作为内参基因，采用2-ΔΔCt 法计算miRNA 相对表达量；靶基因表达量检测采用RPLP0作为内参基因，MTT 结果采用式（1）计算。

细胞增殖率=
()试验组OD 值-空白组OD 值()
对照组OD 值-空白组OD 值×
100%
（1）　
双荧光素酶报告基因检测数据以萤火虫荧光素酶的荧光强度与海肾荧光素酶的荧光强度比值作为荧光值。

数据采用平均值±标准差表示，所有试验均重复3次，经SPSS 22.0进行单因素方差分析，P <0.05为差异显著，P <0.01为差异极显著。

2 结果与分析
2.1　bta-miR-1343-3p 靶基因预测结果
采用miRanda 软件预测bta -miR -1343-3p 的靶mRNA ，为进一步证实预测的准确性，采用TargetScan 、miRDB 软件对miRanda 预测结果进行
验证，结合2个软件预测结果发现，NEDD8基因的3'UTR 存在bta -miR -1343-3p 的种子区结合位点（图1），RNA hybrid 结果如图2所示。

表3 荧光定量PCR 引物序列
Tab.3 Primer sequences of qRT-PCR
基因　Gene NEDD8Bax CDK4CDK1RPLP0Fas
bta -miR -1343-3p
U6
引物序列（5'—3'）　Primer sequence （5'-3'）F ：ACAGTGGCAAACAGATGAATGAT R ：CAGACACACAAGACTGGGCA F ：GGCCCTTTTGCTTCAGGGT R ：ACTCGCTCAGCTTCTTGGTG F ：CCTTCATGCCAACTGCATCG R ：CCAGAGTGTAACAACCACAGG F ：TGGCGCTTGGAAGTTAGGG R ：GGTATGGTAGACCCCGGCTTT F ：CAACCCTGAAGTGCTTGACAT R ：AGGCAGATGGATCAGCCA F ：AACAGTTTA TGGGCCCTCCT R ：CATCATTTGAGGCTGCAGAG F ：CTCCTGGGGCCCGCACTCTC F ：TCGCTTCGGCAGCACATATAC R ：GCGTGTCATCCTTGCGCAG
产物大小/bp Fragment length
23511614884224121235
224
图2　bta-miR-1343-3p 与NEDD8 mRNA 3′UTR 的杂交位点
Fig.2　Hybridization site of bta-miR-1343-3p and
3′UTR of NEDD8
mRNA
图1　bta-miR-1343-3p 与NEDD8 mRNA 3′UTR 结合位点
Fig.1　Binding sites between bta-miR-1343-3p and
NEDD8 mRNA 3′UTR
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2.2　双荧光素酶报告基因检测结果
双荧光素报告检测结果如图3所示。

共转染双荧光素酶报告基因载体与和bta -miR -1343-3p mimics 后检测细胞内萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，结果表明（图3），在野生型报告载体+mimics 组中，与对照组相比，bta -miR -1343-3p mimics 组的荧光素酶活性显著低于对照组（P <0.05），而其他组中荧光素酶活性无显著差异。

2.3　bta-miR-1343-3p 对卵泡颗粒细胞增殖的影响
在卵泡颗粒细胞中转染bta -miR -1343-3p mimics 以及抑制物（inhibitors ）并采用MTT 法检测细胞增殖情况，结果如图4所示。

从图4可以看出，颗粒细胞中转染mimics 后24、48、72、96 h 后细胞增殖率显著下降（P <0.05）；转染inhibitor 后，细胞增殖率相比对照组显著上升（P <0.05）。

2.4　bta-miR-1343-3p 对卵泡颗粒细胞增殖与凋亡相关基因的影响
在牛卵泡颗粒细胞中转染bta -miR -1343-3p mimics 和inhibitors 后bta -miR -1343-3p 结果如图5所示。

由图5可知，与NC 相比，mimics 组中bta -miR -1343-3p 的表达量极显著高于对照组（P <0.001）；转染 inhibitors 后，相比对照组，试验组中bta -miR -1343-3p 表达量极显著下降（P <0.001）。

采用qRT -PCR 检测转染bta -miR -1343-3p mimics 和inhibitors 后，卵泡颗粒细胞中NEDD8基因的表达情况如图6
所示。

*、**、***分别表示处理在0.05、0.01、0.001水平上差异显著和极显
著。

下图同
*, **, *** indicated significant differences and extremely significant dif‐ferences at 0.05, 0.01, 0.001 level, respectively. The same as below
图3　双荧光素报告检测结果
Fig.3　
Results of dual luciferase reporter assay
图4　bta-miR-1343-3p 对牛卵泡颗粒细胞增殖率的影响
Fig.4　
Influences of bta-miR-1343-3p on proliferation rate of bovine follicular GCs
图5　转染mimics 与inhibitors 之后bta-miR-1343-3p
相对表达量
Fig.5　Relative expression level of bta-miR-1343-3p
after mimics and inhibitors transfection
图6　转染mimics 与inhibitors 之后NEDD8相对表达情况
Fig.6　Relative expression level of NEDD8 after
mimics and inhibitors transfection
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由图6可知，相比对照组，转染mimics 的细胞中NEDD8基因的表达量极显著下降（P <0.01），而转染inhibitors 细胞的NEDD8基因的表达量显著上升（P <0.05）。

按照上述方法对细胞增殖与凋亡相关基因进行表达量的验证，结果如图7所示，转染bta -miR -1343-3p mimics 和inhibitors 后，细胞周期相关基因CDK1与CDK4在过表达bta -miR -1343-3p 后表达
量显著下降（P <0.05）；相反，抑制bta -miR -1343-3p 表达后，CDK1与CDK4基因的表达量显著上升（P <0.05）。

检测细胞凋亡相关基因Bax 与Fas 后发现（图8），过表达bta -miR -1343-3p 后Bax 表达量显著上升（P <0.05），Fas 表达量升高但差异不显著，但在抑制bta -miR -1343-3p 表达后，试验组中Bax 与Fas 表达量均极显著下降（P <0.01）。

3 结论与讨论
腔前卵泡的生长不依赖促性腺激素，而有腔卵泡的生长依赖FSH 和LH [21-23]。

卵泡生长过程中健康的卵母细胞以自分泌和旁分泌方式与卵泡生态体系中的颗粒细胞共同发挥作用，影响卵泡发育进程，并影响卵泡的最终命运。

因此，本研究主要围绕有腔卵泡中bta -miR -1343-3p 对卵泡颗粒细胞的影响开展，分离卵巢皮质中大小为4~8 mm 的生长期有腔卵泡并进行体外培养。

采用miRanda 软件对bta -miR -1343-3p 的靶位
点进行预测，发现其与NEDD8基因mRNA 的3'UTR 存在潜在的结合位点，bta -miR -1343-3p 成熟序列在人和小鼠中完全保守。

进一步采用TargetScan 和miRDB 数据库预测bta -miR -1343-3p 的靶基因并得到相同的结果，因此，认为预测结果准确。

成熟的miRNA 可与Argonaute 蛋白组装成miRNA 诱导的沉默复合物（miRISC ），并通过miRNA 种子区域（2~8位核酸互补配对）和mRNA 3'UTR 内的互补位点之间的配对与靶标mRNA 结合[24]，NEDD8 mRNA 与bta -miR -1343-3p RNA 的分子杂交图显示，
二者间存在靶向关系。

图7　转染mimics 与inhibitors 后细胞周期相关基因CDK1和CDK4的相对表达情况
Fig.7　Relative expression level of cell cycle-related genes CDK1 and CDK4
after mimics and inhibitors transfection
图8　转染mimics 与inhibitors 后凋亡相关基因的相对表达情况
Fig.8　Relative expression level of apoptosis-related genes after mimics and inhibitors transfection
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通过构建NEDD8 mRNA 3'UTR的双荧光素酶野生型载体以及种子区突变型载体，转染293T细胞后证实了bta-miR-1343-3p与NEDD8基因之间存在靶向关系。

将bta-miR-1343-3p mimics与inhibitors转染至牛卵泡颗粒细胞中后，发现bta-miR-1343-3p表达量极显著上升，而转染抑制物后bta-miR-1343-3p表达量极显著下降，证明可将bta-miR-1343-3p在卵泡颗粒细胞中过表达与沉默同时发现bta-miR-1343-3p在颗粒细胞中过表达后，NEDD8表达量显著降低。

表明bta-miR-1343-3p与NEDD8基因之间存在负调控作用，bta-miR-1343-3p在颗粒细胞中可通过调节NEDD8基因的表达影响卵泡颗粒细胞的功能。

作为一种新的泛素样蛋白，NEDD8蛋白在细胞中对蛋白质的分解与调控作用起着非常重要的作用[25]。

NEDD8蛋白调控细胞中多种代谢途径的方式为Neddylation，与底物结合后可进行复杂的级联反应[26]。

Neddylation激活Cullins的泛素E3连接酶活性后，NEDD化的Cullins蛋白构象发生变化并诱导底物发生泛素化，进而影响细胞内多种生命活动[27]。

此外，Neddylation还可与泛素化过程竞争，p53和表皮生长因子（Epidermal growth factor receptor，简称为EGFR）上的某些赖氨酸残基既可以与NEDD8结合又可与泛素结合，抑制或降解底物。

研究发现，Neddylation可通过诱导细胞凋亡、衰老和自噬抑制肿瘤细胞的生长[28-29]。

卵泡闭锁过程不仅与卵泡内激素水平有关，也与卵泡颗粒细胞的凋亡高度相关。

卵泡闭锁存在于卵泡发育的整个过程，由于闭锁卵泡发育阶段的不同导致其闭锁的具体过程存在差异，闭锁早期均出现卵泡颗粒细胞的凋亡[30]。

研究发现，与正常卵泡相比，闭锁卵泡中凋亡相关基因p53表达量显著上升[31- 32]。

p53蛋白在细胞生存与凋亡过程中发挥作用依赖于泛素化、磷酸化、乙酰化等修饰过程[31,33]。

此外，p53蛋白的活性由cullin-RING 泛素连接酶MDM2抑制，而MDM2可通过泛素-蛋白酶体途径降解p53。

也有报道表明，MDM2可作为p53的NEDD8-E3连接酶[34]，p53蛋白超家族中成员p73也能被NEDD化所抑制活性[35]。

在卵泡颗粒细胞中过表达与沉默bta-miR-1343-3p后检测细胞的增殖情况，MTT结果表明，bta-miR-1343-3p的过表达会抑制颗粒细胞的增殖，而bta-miR-1343-3p沉默会促进颗粒细胞增殖。

这一结果表明，在卵泡颗粒细胞中bta-miR-1343-3p可通过抑制NEDD8的表达促进颗粒细胞的凋亡。

这与其他研究中报道的NEDD8诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的生长的结果一致[36-37]。

进一步在bta-miR-1343-3p过表达和抑制的细胞中检测CDK1与CDK4基因的表达量，结果发现，过表达bta-miR-1343-3p时细胞周期相关基因表达量显著下降，抑制bta-miR-1343-3p时表达量显著上升。

细胞凋亡相关基因Bax则在过表达bta-miR-1343-3p后表达量显著升高，Fas基因表达量有所升高但差异不显著。

上述结果可与之前的MTT 结果相互印证，说明bta-miR-1343-3p通过靶向调节NEDD8基因的表达抑制了卵泡颗粒细胞的增殖。

综上所述，bta-miR-1343-3p靶向的NEDD8基因调控了牛卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡，对卵泡发育起着重要的作用。

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