发育过程中形态发生素梯度形成和信号转导的调控机制

项目名称：发育过程中形态发生素梯度形成和信号
转导的调控机制
首席科学家：林鑫华中国科学院动物研究所起止年限：2011.1至2015.8
依托部门：中国科学院
二、预期目标
1、项目总体目标
本项目针对形态发生素梯度形成和信号转导的调控机制这一发育生物学研究领域的关键问题，整合在形态发生素研究领域已做出优秀成绩的研究单位和科学家，以果蝇、斑马鱼、小鼠等模式动物和细胞系为研究体系，利用遗传学、发育生物学、细胞生物学和生物化学等实验技术，系统地研究形态发生素的分泌、梯度形成和信号转导的调控，发现形态发生素与其它重要发育信号之间相互作用及机制，完善形态发生素信号转导与调控的分子网络，阐明形态发生素梯度形成和信号转导的调控机制在胚胎发育和组织器官形成中的重要作用，进一步探讨形态发生素在多种人类重要疾病（如先天性缺陷、肿瘤）中的作用机制。

以上研究结果将揭示形态发生素梯度形成和信号转导这一重要发育生物学问题的新机制，获得一系列具有国际领先和拥有自主知识产权的研究成果，打造一支达到国际先进水平的发育生物学研究团队，使我国在此领域的研究处于世界领先行列。

同时本项目的实施也将有助于阐明相关人类疾病的发病机制，为疾病诊断和药物开发提供理论基础和科学依据，为人类健康做出重要贡献。

2、五年预期目标
在基础理论研究方面：揭示形态发生素梯度形成和信号转导的新机制；发现并鉴定参与形态发生素相关信号通路的新基因；解释这些新基因在发育过程中和人类疾病中的功能和作用机制；发现形态发生素信号与其它重要发育信号间相互关系及其在人类疾病发生和发展过程中的作用；完善形态发生素信号转导与调控的分子网络；阐明形态发生素梯度形成和信号转导在胚胎发育和组织器官形成中的重要作用；探讨形态发生素在多种人类重大疾病（如先天性缺陷、肿瘤）中的作用机制。

在应用基础研究方面：Wnt、Hh、BMP、JNK、Hippo等信号通路与多种人类疾病密切相关，本项目将鉴定出这些信号通路中的未知成员，为相关疾病的诊断和治疗提供新的检测方法、治疗方案和药物靶点。

在平台建设方面：建立一个完整而系统的形态发生素研究体系和技术平台,包括用于研究的人力资源、实验材料、实验方法和技术手段等。

该平台的建立将为研究团队高效率、高水平完成形态发生素及相关发育生物学科研任务提供良好
的基础条件，增强我国在这些研究领域的国际竞争力。

在人才培养方面：培养硕士及博士研究生100名，博士后15-20名，国家杰出青年等高级人才2-3名。

成果考核指标：在国际一流杂志（IF >10）发表论文12-16篇，在有影响力的杂志（IF >5）上发表论文40-50篇。

申请5-10项发明专利。

三、研究方案
1. 学术思路
形态发生素作为形态构建的组织者，对多种发育过程均起到至关重要的作用。

了解形态发生素的作用机制是深入理解图式形成和器官发生的关键。

对形态发生素的研究不仅为组织工程和器官修复提供实验依据和理论基础，同时为出生缺陷、癌症等重大疾病的预防、诊断及治疗开辟新的途径。

本项目将对形态发生素的分布及其信号转导机制开展系统性研究，利用多种模式动物（果蝇、斑马鱼、小鼠等）的研究优势，力求从遗传学、生物化学、细胞生物学及分子生物学等不同角度出发，回答形态发生素梯度形成及信号转导的关键问题。

我们将利用果蝇模式动物完善的遗传学研究系统，首先分析形态发生素梯度形成和信号转导的分子机制；其次研究形态发生素与JNK及Hippo信号通路间的相互作用，深入理解各种信号通路如何协同调控胚胎发育和图式形成；最后，我们利用斑马鱼研究形态发生素在脊椎动物胚胎发育中的作用，并用斑马鱼和小鼠的心血管系统为模型研究形态发生素信号通路对器官发生的作用。

总之，本项目的实施将解决形态发生素梯度形成及信号转导的一系列关键问题；揭示发育过程中形态发生素的梯度形成及信号转导的调控机制。

这些结果不仅会对形态发生素梯度形成的基础理论做出重要贡献，而且有助于阐明相关重大疾病的发生机制，并为相关疾病的诊治奠定理论基础。

2. 技术途径
本项目充分利用果蝇、斑马鱼等模式动物的优势，整合国内优秀团队，利用当前最先进的研究手段和技术，对发育过程中形态发生素的表达、分泌、梯度形成和信号转导，以及与其它重要信号通路间的相互作用进行研究，揭示形态发生素与其它重要信号间的互动机制，构建完整的信号转导网络，并阐明其在胚胎发育和人类疾病中的重要作用。

围绕项目研究内容和目的，本课题将在分子、细胞和整体动物水平上开展研究。

在研究手段上将突出系统性、动态性，同时将注重发展并使用新方法。

在分子水平的研究中，除了常规的研究方法外，将开展多标记、定量和实时的方法对基因转录、蛋白质翻译、蛋白质修饰以及蛋白质相互作用进行动态研究，
如实时定量PCR、荧光素酶定量分析、蛋白质修饰位点确定、修饰位点突变、报告基因活性分析、免疫共沉淀实验等。

在细胞水平的研究中，将突出活细胞研究技术，如活细胞荧光免疫观察、活细胞内标记蛋白质的动态多维观察、活细胞囊泡运输观察等。

通过结合常规的固定细胞研究技术和活细胞研究的方法，更好地认识细胞内信号转导分子和通路在调控细胞活动中的作用。

在分子和细胞水平的机制性研究基础上，我们还将在整体动物模型上进行基因的功能分析。

利用果蝇、斑马鱼和小鼠等模型对形态发生素信号及其它相关发育信号的功能开展体内生理条件下的研究，如采用果蝇嵌合体突变技术、RNAi 干涉技术、过量表达技术、可阻遏细胞标记技术（MARCM system）以及斑马鱼Morpholino干涉技术、转基因鱼荧光活体观察技术、小鼠基因敲除技术等。

本项目针对细胞生长调控的几个关键要点和过程设置了相应的四个研究课题，包括 (1) Wnt梯度形成和信号转导的调控机制；(2) Hh梯度形成和信号转导的调控机制；(3) 形态发生素信号通路与JNK、Hippo信号通路的相互作用；(4) 形态发生素在脊椎动物胚胎发育和组织器官形成中的功能和作用机制。

总体技术途径如下图：
3、创新点与特色
科学问题： 形态发生素信号通路在正常发育和疾病发生过程中都有重要的作用，是发育生物学领域一个极为重要的研究方向。

虽然经过多年的努力，我们已经对其信号通路的主要成员和基本作用机制有了一定的了解，但对于其浓度梯度形成、信号转导和不同信号间相互作用等诸多问题还知之甚少。

本项目针对形态发生素信号通路中几个极为重要且尚待研究的科学问题，力图通过利用不同模式生物的研究优势，采用现有多种稳定有效的研究方法，并应用新的技术和研究手段来解决这些重要的科学问题。

研究内容：本项目抓住形态发生素信号通路的几个关键要点，同时从多个重要的信号通路Wnt 、Hh 、TGF-β、JNK 和Hippo 出发，利用果蝇全基因组RNAi 文库、果蝇全基因组过表达文库和蛋白质组学等多种手段，鉴定参与形态发生素信号通路的新基因，研究这些基因在形态发生素梯度形成和信号转导中的功能和机制，揭示不同信号通路之间的相互作用，进而探究形态发生素信号在正常发育和疾病发生过程中功能和作用机制，形成一个由表及里、相互关联的研究体系。

总体技术途径示意图
研究系统：本项目针对形态发生素梯度形成和信号通路调控机制这一发育生物学关键问题，从分子、细胞和整体动物多个层次，利用果蝇、斑马鱼、小鼠等模型并结合哺乳动物细胞，有利于更好地鉴定参与形态发生素信号通路的新基因，分析基因在信号通路中的新功能，发现信号通路调控的新机制。

研究方法：本项目综合运用遗传学、细胞生物学、分子生物学、生物化学、蛋白质组学和生物信息学等方面的研究思想和技术方法，系统地研究形态发生素梯度形成和信号通路调控机制。

充分利用不同模式生物的优势，结合果蝇嵌合体分析技术、过量表达分析技术、斑马鱼morpholino干涉技术和小鼠组织特异性敲除技术对形态发生素信号通路进行系统性研究。

针对基因功能和作用机制的研究，我们结合细胞活体染色观察囊泡运输、蛋白质亚细胞定位、荧光素酶定量分析、免疫共沉淀、酵母双杂交和基因定点突变等微观分析手段对形态发生素分子及其信号进行直观的、动态的、定量的分析。

研究队伍：本项目由形态发生素研究领域资深专家林鑫华博士领衔, 并汇集了在形态发生素及胚胎发育研究领域已做出优秀成绩的中青年科学家，他们在各自研究领域都有很好的研究基础和特色的科研成果。

项目整体分为4个研究课题，每个课题由7-8名研究方向一致的研究人员组成，能相互合作集中解决本课题内的关键科学问题。

4个课题之间又可以紧密联系、相互促进。

例如在课题一Wnt 信号通路中发现的新分子、新机制可以用于课题二Hh信号通路的研究。

课题一和课题二的研究成果则可以作为课题三研究的基础，将有利于阐明形态发生素信号通路与其它发育信号通路之间的关系。

由于形态发生素信号通路从果蝇到哺乳动物高度保守，所以前三个课题的基础研究成果可以应用到课题四在脊椎动物模型中进行功能分析和机制研究。

研究队伍的所有成员都能够相互借鉴，互助合作，形成长期而良好的科研合作平台。

4、可行性分析
本项目抓住形态发生素信号通路的几个关键要点，同时从多个重要的信号通路Wnt、Hh、TGF-β、JNK和Hippo出发，通过多种筛选手段鉴定参与形态发生素信号通路的新基因，研究这些基因在形态发生素梯度形成和信号转导中的功能和机制，揭示不同信号通路之间的相互作用，进而探究形态发生素信号在正常发育和疾病发生过程中的功能和作用机制，形成了一个由表及里、相互关联的研究体系。

目前利用果蝇全基因组RNAi干涉文库和果蝇全基因组过表达文库系统进行
的遗传筛选工作已经获得了多个参与形态发生素信号调控的新基因，初步实验结果显示这些新基因很可能有新的功能和新的作用机制，我们正力图将这些基因融合进现有的信号通路，构建一个完善的形态发生素信号调控网络图谱。

现有的实验结果已经证明我们的研究体系和研究手段切实可行。

本研究团队已经承担多项科研任务，其中包括科技部“973”项目、中国科学院创新工程项目、国家自然科学基金项目等，具有很强的科研实力，能够承担国家重大科研任务。

研究组前期的研究工作已经在形态发生素研究领域做出了突出成绩，成果发表在Cell、Nature、Science、Developmental cell、Nature Cell Biol、Development 等国际一流学术期刊上。

同时各个研究组目前已经形成各具特色的研究团队，并且研究组间相互协作形成了一支技术过硬、结构合理的的整体队伍。

本项目课题负责人和主要学术骨干所在的研究组大多依托国家级重点实验室和省部级重点实验室。

其中包括有生物膜与膜生物工程国家重点实验室、中国科学院分子细胞生物学重点实验室, 中国科学院系统生物学重点实验室、中国科学院干细胞重点实验室（筹）、卫生部视觉科学研究重点实验室、上海市信号转导和疾病重点实验室和浙江省眼视光学重点实验室。

各重点实验室及研究中心经过多年的积累和发展，营造了良好的科研环境、配备了较完备的大型专业仪器设备，建立了完善的实验技术和研究系统，为本项目的顺利开展奠定了基础。

此外我们还建设了多个模式生物实验平台，包括果蝇平台、斑马鱼平台、小鼠平台、果蝇显微注射平台、斑马鱼显微注射平台和小鼠胚胎显微注射平台，能够进行大规模转基因动物的构建和大规模遗传筛选。

课题组所在单位主要为中国科学院动物研究所、中国科学院上海生命科学院、南京大学、同济大学、南开大学等具有悠久历史的研究单位，在发育生物学、细胞生物学、遗传学、分子生物学、蛋白质组学、生物信息学和方面都有良好的基础。

各研究组之间可以相互借鉴、优势互补，确保本项目的顺利实施。

5、课题设置及各课题间相互关系
本项目围绕“发育过程中形态发生素梯度形成和信号转导的调控机制”这一关键科学问题，系统地研究形态发生素的梯度形成和信号转导、形态发生素和其它信号通路的相互作用以及在脊椎动物胚胎发育中的作用。

项目分为四个课题：课题一，Wnt梯度形成和信号转导的调控机制；课题二，Hh梯度形成和信号转导的调控机制；课题三，形态发生素信号通路与JNK、Hippo信号通路的相互作用；
课题四，形态发生素在脊椎动物胚胎发育和组织器官形成中的功能和作用机制。

从研究的科学问题来看, 前两个课题将详细阐明两个关键形态发生素Wnt 和Hh的浓度梯度形成和信号传导的分子机制。

该课题的开展不仅使我们进一步完善对Wnt和Hh信号通路中各成员作用机制的认识，而且有助于我们鉴定这些信号通路中的新成员。

课题三将研究JNK和Hippo信号通路与形态发生素信号通路之间的相互作用。

课题一和课题二发现的信号通路新成员和新机制将有助于我们加深理解这些信号通路之间的相互关系，全面认识形态发生素及其相关信号通路控制组织图式形成和器官发育的客观规律，促进项目中课题三和课题四相关研究的实施。

另一方面，充分掌握JNK和Hippo信号通路与Wnt和Hh信号通路的关系，也为我们全面理解Wnt和Hh的整个信号网络提供了重要信息。

前三个课题的目标是揭示形态发生素的浓度梯度形成、信号转导以及各发育信号之间的相互作用；课题四是以斑马鱼和小鼠为模式动物，揭示形态发生素信号通路在脊椎动物胚胎发育和器官发生中的重要作用，因此我们可以将课题一、二和三鉴定出的新成员在课题四的脊椎动物发育系统中进行功能分析。

从实验材料和技术手段共享方面来看，我们已经获得果蝇全基因组RNAi干涉文库和果蝇全基因组过表达文库，并利用这两个全基因组文库筛选到了多个参与Wnt和Hh信号通路的新基因。

下一步我们将利用这两个果蝇文库，筛选JNK和Hippo信号通路的新基因。

同时我们还利用蛋白质质谱、基因芯片等方法找到多个参与Wnt和TGF-β信号通路的新基因，我们将共享这些信息，研究这些基因是否参与其它信号通路。

综合利用以上多种实验材料和技术手段，我们可以在全基因组水平上鉴定Wnt、Hh、TGF-β、JNK和Hippo信号通路的新基因。

同时我们还将完全共享现有的果蝇品系、cDNA文库等重要的实验材料，为研究各个信号通路间相互作用提供基础保障。

本项目由形态发生素研究领域资深专家林鑫华博士主持，同时汇集了国内目前形态发生素研究方面最优秀的中青年科技人才。

本项目包含的四个课题各自独立又紧密相关，形成一个研究形态发生素作用机制和功能的完整体系。

本项目的实施不仅将阐明形态发生素浓度梯度形成和信号转导的分子机制，并且将揭示它们在发育过程中的重要功能。

课题一，Wnt 梯度形成和信号转导的调控机制
研究目标：
本课题以Wnt/Wg 信号通路为研究对象，通过遗传学、细胞生物学和生物化学等手段相结合的方法，研究Wnt/Wg 蛋白从分泌、运输、分布、受体结合到信号传递等各个环节的调控机制，寻找Wnt/Wg 信号通路中未知的调节因子，并揭示它们的调控机制以及在发育过程中的重要作用，从而全面地了解Wnt/Wg 信号通路的分子网络及调控机制。

研究内容：
利用果蝇全基因组RNAi 文库，转基因过表达文库及蛋白质组学，筛选并鉴定Wnt/Wg 信号通路的新基因；研究Wnt/Wg 的分泌和扩散及与受体结合的分子机制；探讨细胞质中各种调节因子如何调控β-Catenin/Armadillo 的稳定性；分析核内β-Catenin/Armadillo 与TCF/Pangolin 复合物如何通过其它调节因子的协同作用调控下游基因的转录；研究Wnt/Wg 信号通路中的新成员及新机制在脊椎动物中的保守性。

课题之间的相互关系
经费比例：32%
承担单位：中国科学院动物研究所、中国科学院上海生命科学研究院、温州医学院
课题负责人：林鑫华
学术骨干：宋海云、江晓勇、金龙金、杨勇飞、叶菊秀
课题二，Hh梯度形成和信号转导的调控机制
研究目标：
本课题结合遗传学、细胞生物学、生物化学及分子生物学多种手段，以果蝇为研究系统，研究形态发生素Hh梯度形成和信号转导的调控机制。

寻找参与Hh信号通路的新基因；揭示Hh浓度梯度形成和信号转导的新机制；阐明Hh在机体发育过程中的作用机制。

研究内容：
利用果蝇全基因组RNAi文库，转基因过表达文库及蛋白质组学，筛选并鉴定参与Hh信号通路调控的新基因；研究Disp蛋白如何调控Hh蛋白分泌；分析Dlp和Ihog影响Hh分布的调控机制；以信号通路的关键分子Smo为靶点，研究其作用机理，分析形态发生素Hh刺激下的信号通路成员的动态变化；研究Ci分子稳定性和活性的调节；研究Hh信号通路中的新成员及新机制在脊椎动物中的保守性。

经费比例：25%
承担单位：中国科学院上海生命科学研究院、南京大学、中国科学院动物研究所课题负责人：赵允
学术骨干：张青、吴一卉、石大伟、吴文青
课题三，形态发生素信号通路与JNK、Hippo信号通路的相互作用
研究目标：
本研究拟利用模式生物果蝇的遗传学优势，从分子、细胞、组织及整体水平，探讨形态发生素信号通路与JNK、Hippo信号通路间的相互作用；寻找参与JNK、Hippo信号通路的新基因；揭示JNK、Hippo信号转导的新机制；构建完整的信
号转导网络；阐明其调控胚胎发育和器官发生的重要作用。

研究内容：
分析JNK信号通路与Wnt/Wg、Hh和BMP/Dpp信号通路之间的相互作用，及对发育的调控机制；探索Hippo信号通路与Wnt/Wg、Hh和BMP/Dpp信号通路之间的相互作用，及对发育的调控机制；研究JNK信号通路与Hippo信号通路间的相互作用，及对发育的调控机制；筛选JNK和Hippo信号通路中的新成员，分析其与Wnt/Wg、Hh和BMP/Dpp通路中各成员的交互关系，构建完整信号转导网络。

经费比例：18%
承担单位：同济大学、南开大学
课题负责人：薛雷
学术骨干：吴世安、赵素然、张欣文、王兰芳
课题四，形态发生素在脊椎动物胚胎发育和组织器官形成中的功能和作用机制
研究目标：
研究形态发生素在脊椎动物胚胎发育和器官发生中的功能和作用机制；了解形态发生素信号通路及靶基因在细胞增殖、分化和凋亡等细胞命运中的作用；揭示形态发生素在胚胎发育和器官发生中的重要作用；探讨形态发生素信号通路与其它信号通路的相互联系，共同调控脊椎动物胚胎发育、血液和心脏发育的分子机制。

研究内容：
应用模式动物斑马鱼阐明形态发生素Nodal信号通路在胚胎发育中的功能；鉴定Smad2直接调控的靶基因，并进一步探讨Smad2通过其靶基因调控胚胎发育的分子机制；分离鉴定Smad2相互作用蛋白，从而了解Smad2的活性与功能的调控机制及在发育中的意义；应用斑马鱼模式动物揭示BMP和FGF在血液和心血管发育中的作用机制；揭示BMP、Wnt、Hh 和FGF等信号通路之间相互关联对造血干细胞维持、形态发生以及细胞命运的调控作用；应用小鼠模式动物阐明形态发生素信号通路Wnt、BMP和FGF信号与Akt 和Hippo信号通路之
间的相互关系，以及在心脏发育中的调控机制。

经费比例：25%
承担单位：南京大学、中国科学院动物研究所课题负责人：杨中州
学术骨干：刘峰、王强、常在、马东媛
四、年度计划
因过表达文库，染色体缺失片断库、1、筛选并鉴定5-10个Wnt信号通路相关、5-10个Hh信号通路相关、5-10个对Hippo信号通路相关和10-20个对JNK信号通路的新基因，并初步分析其体内功能。

2、对已知在Wnt和Hh信号通路中起重要作用的关键调控因子如
-Catenin、Dishevelled、Pygopus、Fu、Cos2和Su(fu)等蛋白的特异性修饰（磷酸化、乙酰化和甲基化修饰）进行鉴定；并找到5-10个有可能影响这些蛋白功能的未知调控因子。

3、找到并鉴定Dlp与Wnt和Hh结合并调节它们分布的关键结构域。

4、揭示Retromer对Wnt分泌的调控
机制。

找到与Retromer对Wnt分泌调控相关的SNX分子；找到并鉴定Disp与Hh结合并调节Hh分泌的关键结构域。

5、确定Nek2、Smi35A和Lic对Wnt信号通路的特异性调控；阐明Smo分子经过Cos2/Fu复合体传递Hh信号的机制。

6、建立以斑马鱼为主体的脊椎动物器官发育研究技术平台；完善以斑马鱼胚胎为实验材料的ChIP-on-chip 实验体系。

7、获得心脏特异剔除PTEN，Wntless，β-Catenin小鼠；并初步分析它们的发育表型；建立Mesp1基因表达检测的体系。

一、研究内容
1、拟解决的关键科学问题
本项目重点研究发育过程中形态发生素浓度梯度形成与信号转导的调控机制。

拟解决以下四个基本科学问题：1、Wnt梯度形成及其信号转导的机制；2、Hh梯度形成及其信号转导的机制；3、形态发生素如何通过与其它发育信号相互作用进而影响发育过程；4、形态发生素在脊椎动物胚胎发育及器官发生过程中的作用及其机制。

2、主要研究内容
本项目将对形态发生素梯度形成和信号转导机制开展系统性研究，围绕上述四个关键科学问题，利用各种模式动物（果蝇、斑马鱼、小鼠等）的研究优势，力求从遗传学、细胞生物学、生物化学及分子生物学等不同角度出发，回答发育过程中形态发生素梯度形成及信号转导的关键问题。

发现形态发生素梯度形成及信号转导通路的未知成员，阐明形态发生素梯度形成及信号转导的调控机制，理解形态发生素与其它发育相关信号通路间的关系，并进一步揭示其在脊椎动物胚层诱导及组织器官形成中的作用。

这些成果不仅会对发育过程中形态发生素梯度形成的基础理论产生重要贡献，而且有助于阐明相关重大疾病的发生机制，并为相关疾病的诊治奠定理论基础。

主要研究内容包括以下几个方面：
（1）Wnt梯度形成和信号转导的调控机制
本课题重点研究Wnt分泌、分布以及信号转导的机制。

Wnt梯度形成和信号传递过程中尚未解决的关键问题包括：Wnt是如何被分泌和在细胞表面扩散的；Wnt与受体的结合如何引发细胞膜上信号分子的变化；在细胞质中各种调节因子如何通过信号传递抑制β-Catenin的降解复合物；进入核内的β-Catenin与TCF组成的复合物如何通过其它调节因子的协同作用调控Wnt通路下游基因的转录。

为了解答以上这些关键科学问题，本课题拟通过遗传学与生物化学手段，寻找Wnt 信号通路中未知的调节因子，揭示它们的调控机制以及在各种生物学过程中的重要作用，全面地阐明Wnt信号通路中各个调节因子组成的信号分子网络及调控机制。

（2）Hh梯度形成和信号转导的调控机制。