去甲泽拉木醛通过抑制AKT

关系仍需要进一步探究。

综上所述，TLR4介导的炎症反应在帕金森病发病机制中的作用被广泛关注，本研究证实，MPTP 诱导的帕金森病小鼠模型同样存在TLR4活化的现象，并可能通过“肠-脑”轴双向作用加剧炎症级联反应。

而白藜芦醇可能通过抑制LPS 诱导的TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路的激活缓解炎症反应，修复肠道屏障，并减少α-syn 在肠道的累积，进而发挥保护多巴胺能神经元的效应。

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图6RES 下调脑黑质区TLR4的表达，上调TH 的表达
Fig.6RES downregulates the expression of TLR4and upregulates the expression of TH in the substantia nigra of the mice.A:Immunofluorescence double-stained image of TLR4-positive neurons (red fluorescence)and TH-positive neurons (green fluorescence)in the substantia nigra of the mice.The fluorescence intensity represents the level of expression (Scale bar:100μm).B:Expression of TLR4.C:Expression of TH.*P <0.05,**P <0.01.
M P T P +R E S 30
M P T P
C o n t r o l
T L R 4e x p r e s s i o n
500450400350300250200150100500
Control
MPTP MPTP+RES30
Control MPTP MPTP+RES30
T H e x p r e s s i o n
4000
3500300025002000150010005000
A
B
C MERGE
TLR4
TH
**
*
**
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（编辑：林萍）
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·279
肺癌是全球最常诊断的癌症之一，也是癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC ）是肺癌最
常见的一种亚型，占比达80%［1,2］。

目前肺癌的治疗方法
包括手术切除、辅助靶向治疗、放化疗、联合免疫治疗
等，还有一些新兴治疗方法：例如抗体药物偶联物和肿瘤电场疗法等，但其预后仍然不容乐观［3］，由于目前NSCLC 治疗方案产生的耐药性和副作用，有效治疗肺癌仍然是一个重要的临床挑战，积极寻找开发新的药物和联合治疗方法非常重要。

近年来，从天然化合物中筛选出安全有效的抗肿瘤
Demethylzeylasteral inhibits proliferation,migration and invasion and promotes apoptosis of non-small cell lung cancer cells by inhibiting the AKT/CREB signaling pathway
HAN Qiqi 1,YE Mengran 1,JIN Qili 1,21
School of Laboratory Medicine,Bengbu Medical University,Bengbu 233030,China;2Department of Laboratory Medicine,Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical University,Bengbu 233080,China
摘要：目的探讨去甲泽拉木醛抑制非小细胞肺癌细胞A549和H1299增殖、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡的作用机制。

方法镜
下初步观察不同浓度的去甲泽拉木醛（0、1、3、10、30μmol/L ）对A549和H1299细胞形态及细胞数量的影响。

通过克隆形成、CCK-8、细胞划痕、Transwell 和流式细胞实验检测去甲泽拉木醛对A549和H1299细胞增殖、细胞活力、细胞迁移和侵袭、细胞凋亡的影响以及SC79处理后对细胞凋亡的影响。

通过Western blotting 检测不同浓度的去甲泽拉木醛对A549和H1299细胞E-cadherin 、N-cadherin 、Vimentin 、Bax 、Bcl-2、cleaved-caspase 3表达和AKT/CREB 磷酸化水平变化的影响，SC79处理后对凋亡蛋白表达的影响。

结果镜下观察药物作用后，细胞形态由饱满变为细长，细胞间隙增宽。

CCK-8实验和克隆形成实验结果显示去甲泽拉木醛能抑制A549和H1299细胞活力并且抑制细胞的增殖（P <0.05）。

流式细胞术结果表明，去甲泽拉木醛诱导A549和H1299细胞的凋亡，而SC79处理后逆转了促凋亡作用（P <0.05）。

划痕和Transwell 实验结果说明，去甲泽拉木醛抑制了A549和H1299细胞的迁移和侵袭（P <0.05）。

Western blotting 实验结果表明，去甲泽拉木醛处理后A549和H299细胞中Bax 、clevaed-caspase3蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平下调，而SC79的使用逆转了凋亡蛋白的表达趋势，E-cadherin 表达上调，N-cadherin 、Vimentin 表达下调，AKT/CREB 磷酸化水平也被显著抑制（P <0.05）。

结论去甲泽拉木醛能够抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导其凋亡，其机制可能与其抑制AKT/CREB 信号通路有关。

关键词：非小细胞肺癌；去甲泽拉木醛；AKT ；CREB
Abstract:Objective To investigate the mechanism underlying the inhibitory effects of Demethylzeylasteral (T-96)on non-small cell lung cancer (NSCLC)cells.Methods We first examined the effects of different concentrations (1,3,10,and 30μmol/L)of demethylzeylasteral on morphology and cell number of A549and H1299cells.The changes in proliferation,cell viability,migration,invasion,and apoptosis of A549and H1299cells following demethylzeylasteral treatment were detected using clone formation,CCK-8,cell scratch,Transwell,and flow cytometric assays,and the effect of SC79treatment against demethylzeylasteral-induced cell apoptosis was assessed.Western blotting was performed to detect the changes in expressions of E-cadherin,N-cadherin,vimentin,Bax,Bcl-2and cleaved caspase-3and phosphorylation of AKT/CREB in demethylzeylasteral-treated A549and H1299cells and the cellular expressions of apoptotic proteins following treatment with both demethylzeylasteral and SC79.Results T-96treatment caused elongation of the cell body and widening of the intercellular space and significantly inhibited cell viability,proliferation,migration and invasion of A549and H1299cells (P <0.05).Flow cytometry showed that demethylzeylasteral induced apoptosis in both A549and H1299cells,whereas SC79treatment obviously attenuated its pro-apoptotic effect (P <0.05).Western blotting revealed up-regulated expressions of Bax and cleaved caspase-3proteins and lowered Bcl-2expression level in demethylzeylasteral-treated A549and H1299cells,but co-treatment with SC79obviously attenuated the expressions of the apoptotic proteins.T-96significantly up-regulated the expression level of E-cadherin,down-regulated the expressions of N-cadherin and vimentin,and inhibited the phosphorylation of AKT and CREB in the two cell lines (P <0.05).Conclusion T-96inhibits the proliferation,migration and invasion and induces apoptosis of NSCLC cells possibly by inhibiting the AKT/CREB signaling pathway.Keywords:non-small cell lung cancer;demethylzeylasteral;AKT;CREB
收稿日期：2023-10-31
基金项目：安徽省高校自然科学研究重点项目（2023AH051974）作者简介：韩齐齐，在读硕士研究生，E-mail:*****************通信作者：金齐力，主任技师/副教授，硕士，E-mail:*****************doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2024.02.10J South Med Univ,2024,44(2):280-288
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成分成为开发新的抗肿瘤药物的趋势，例如，紫杉醇、长春新碱和喜树碱等已被广泛用于预防和治疗癌症，槲皮素、木犀草素、山奈酚等天然化合物具有的抗肿瘤特性也被广泛研究［4］。

在中国，天然化合物基于中医疗法已经作为放化疗、手术切除等肿瘤治疗的辅助治疗手段，有很大的治疗前景，NSCLC标准治疗后的中医辅助治疗可缓解症状，提高生活质量［5］，并且相较于其他放化疗药物，中药或其衍生物有更低的毒副作用［6］，有研究表明，天然产物不仅能够增强顺铂治疗效果，而且还能减弱其化疗所导致的毒副作用［7］。

去甲泽拉木醛（T-96）是从天然产物雷公藤中提取的去甲木栓烷型三萜类化合物，雷公藤具有广泛药理作用，不仅可以在抗炎、抗病毒等方面发挥作用，还有较强的抗肿瘤作用，在肺癌［8］、结直肠癌［9］、胃癌［10］等多种恶性肿瘤中均有报道，并且相比较于雷公藤二萜类、生物碱类成分，三萜类化合物毒性更低、不良反应少，有很大的治疗潜力［11］。

蛋白激酶B（AKT）的异常激活对肿瘤的生长和进展至关重要，AKT的激活启动磷酸化级联反应，激活下游调控细胞生长、蛋白质合成、抑制细胞凋亡的分子［12］，环腺苷酸反应元件结合蛋白（CREB）是AKT的众多下游分子中的一个，可以调控基因的转录，影响多种信号的转导，CREB在造血和实体肿瘤中高表达，主要通过磷酸化CREB残基（Ser133）来发挥其活性，CREB的活化导致控制肿瘤发展的下游基因表达失调，引起异常的信号传导，进而引起肿瘤细胞的无限增殖［13-15］，因此，抑制AKT以及下游分子的活化成为癌症治疗中的有效手段。

尽管有许多研究报道了去甲泽拉木醛的抗癌、抗炎药效，但其能否对肺癌细胞的生长发挥抑制作用，以及是否可以影响AKT的活化尚不清楚。

本研究主要以非小细胞肺癌A549和H1299细胞为研究对象，体外观察去甲泽拉木醛对于A549和H1299细胞增殖、细胞活力、凋亡和迁移侵袭的作用，并进一步探究可能的作用机制，为非小细胞肺癌的治疗或辅助治疗提供新的理论依据。

1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验细胞和药物非小细胞肺癌细胞株A549和H1299（赛库生物）；去甲泽拉木醛粉末和SC79（MCE）。

1.1.2试剂和仪器RPMI1640培养基、胎牛血清（Gibco）；青链霉素双抗（100×）、胰酶消化液（含EDTA）、CCK-8试剂、PMSF、RIPA裂解液（Biosharp）；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒（联科生物）；二甲基亚砜（DMSO）、特超敏化学发光底物ECL、蛋白上样缓冲液（5×SDS）、BCA蛋白定量试剂盒（碧云天）；兔源性一抗Bcl-2，Bax，β-Actin，cleaved-caspase3，E-cadherin、
N-cadherin、Vimentin、AKT和P-AKT，CREB和P-CREB、连接HRP的二抗（CST）；三色Marker和PAGE 快速凝胶配制盒（雅酶）；硝酸纤维素印迹NC膜（GE Healthcare Life Science）。

恒温培养箱、酶标仪Spectrophometer（ThermoFisher）；显微镜，DMI4000B （Leica）；可调温高速离心机（Eppendorf）；流式细胞仪Beckman CytoFLEX flow cytometer（贝克曼）；Tanon-5200成像系统（天能）；垂直凝胶电泳系统（BIO-RAD）。

1.2实验方法
1.2.1细胞培养A549、H1299细胞所用培养基为含有10%FBS、1%青链霉素的RPMI1640完全培养基，置于37℃、5%CO2恒定培养箱中培养，在细胞处于对数生长期时进行相关实验。

1.2.2CCK-8检测细胞活力收集细胞，以1×104/孔的密度接种于96孔板中，混匀，放入培养箱，待细胞贴壁后，加入含去甲泽拉木醛浓度为0、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100μmol/L的完全培养基，继续培养24h和48h，更换含10%的CCK-8溶液的完全培养基，培养箱避光孵育1h，使用酶标仪于450nm处检测每孔A值，并计算细胞活力，细胞活力（%）=（A加药-A空白）/（A对照-A空白）×100%，实验重复3次。

1.2.3克隆形成实验检测细胞增殖收集细胞，制备为1×103/mL的细胞悬液，向6孔板中加入100μL细胞悬液，配制成含有0、0.1、0.3、1、3、10μmol/L去甲泽拉木醛的培养基，培养7~10d，显微镜下观察克隆细胞团的形成情况。

弃去培养基，PBS轻洗，每孔加入4%多聚甲醛中固定30min，再加入结晶紫溶液染色30min，染色结束后用流水轻洗孔板，晾干后拍照并计数克隆细胞团数目，实验重复3次。

1.2.4细胞形态学观察收集细胞，按2×105/孔的细胞密度接种于6孔板中，待细胞密度达到80%左右，弃去培养基，加入含去甲泽拉木醛浓度为0、1、3、10、30μmol/L 的完全培养基继续培养48h，倒置显微镜下观察细胞形态、数量的变化情况，实验重复3次。

1.2.5划痕愈合实验收集细胞接种于6孔板中培养，待细胞汇合密度达90%以上，用移液枪枪头沿直尺在培养板底部划十字线，用PBS冲洗表面后，显微镜下观察并拍照记录0h的划痕面积，之后每孔加入含有0、0.1、0.3、1μmol/L去甲泽拉木醛的基础培养基，放入培养箱继续培养48h，在显微镜下观察并拍照记录48h的划痕面积。

用ImageJ计算划痕面积，代入公式计算细胞迁移率，实验重复3次。

细胞迁移率=（0h划痕面积-48h划痕面积）/0h划痕面积×100%。

1.2.6Transwell侵袭实验取24孔板和Transwell小室，在小室上层加入100μL的基础培养基与基质胶混合物（基质胶∶培养基=1∶10），放入培养箱中固定。

收集细胞，加入基础培养基，制成细胞悬液，将细胞密度调整
J South Med Univ,2024,44(2):280-288·
·281
至1×105/mL ，取100μL 含有0、0.1、0.3、1μmol/L 去甲泽拉木醛的细胞悬液加入到小室上层，在24孔板下室中加入600μL 完全培养基，放入培养箱中培养48h 后，取出小室，用棉棒擦拭上层，放入4%多聚甲醛中固定30min ，用PBS 轻洗小室，将小室置于结晶紫溶液中染色30min ，染色结束后，PBS 轻洗小室并晾干，显微镜下拍照并计数穿过小室的细胞数目，实验重复3次。

1.2.7流式细胞术细胞凋亡收集细胞制成细胞悬液，调整为1×106/mL ，混匀后每孔500μL 接种于6孔板中，每孔补加1.5mL 完全培养基，混匀，放入培养箱，待细胞贴壁并增殖到70%~80%，加入含去甲泽拉木醛浓度为0、1、3、10、30μmol/L 的完全培养基继续培养48h ，收集细胞。

避光加入Annexin V-FITC 和PI 染料，流式细胞仪上机检测，实验重复3次。

1.2.8Western blotting 蛋白印迹分析药物处理过程同凋亡检测的药物处理，将6孔板置于冰上，加入合适体积的裂解液（RIPA ∶PMSF=100∶1），待充分裂解细胞刮刀收集，BCA 蛋白定量之后加入蛋白上样缓冲液，加热变性。

蛋白上样，电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2h 后4℃过夜孵育一抗，洗膜后加入二抗室温孵育2h ，再次洗膜后显影曝光，实验重复3次。

1.3统计学分析
研究结果以均数±标准差表示，两组之间比较采用t 检验，两组以上比较采用方差分析，使用GraphPad Prism8.0进行分析，P <0.05认为差异具有统计学意义。

2结果
2.1去甲泽拉木醛抑制非小细胞肺癌细胞增殖
CCK-8检测结果显示，随着药物浓度的升高，细胞活力逐渐下降，48h 的药物抑制细胞活力的作用更强（P <0.05，图1A 、B ）。

克隆形成实验结果显示，与空白组对比，克隆细胞团数量随剂量梯度效应而减少（P <0.05，图1C~E ）。

2.2去甲泽拉木醛改变非小细胞肺癌细胞形态
在倒置显微镜下观察，相较于对照组，不同药物浓度1、3、10、30μmol/L 处理两株细胞48h 后，细胞形态和数量发生显著变化：随着药物浓度的逐渐升高，细胞由形态饱满变为细长状，由紧密排列状变为细胞间隙增宽，贴壁细胞数目减少、飘浮细胞（死亡细胞）数目增多（图1F ）。

2.3去甲泽拉木醛诱导非小细胞肺癌细胞凋亡
流式细胞术分析结果表明，随着药物浓度的增大，凋亡细胞的比例增加，且具有浓度依赖性（P <0.05，图2A~C ）。

通过Western blotting 检测了相关凋亡蛋白Bcl-2、Bax 和clevaed-caspase3的表达情况，结果显示促凋亡蛋白Bax 表达上调，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达
下调，clevaed-caspase3表达上调（P <0.05，图2D~G ）。

2.4去甲泽拉木醛抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭
划痕实验的结果表明，与空白组相比，去甲泽拉木醛明显延长了两株肺癌细胞划痕愈合的时间，并且呈浓度依赖（P <0.05，图3A~C ）。

Transwell 实验进一步表明，去甲泽拉木醛处理后两株肺癌细胞的侵袭能力受到显著抑制，并且呈剂量依赖（P <0.05，图3D 、E ）。

Western blotting 结果显示，随着药物浓度的增高，E-cadherin 的表达上调，N-cadherin 、Vimentin 的表达下调（P <0.05，图4F~I ）。

2.5去甲泽拉木醛抑制AKT 及其下游分子CREB 磷酸化
通过Western blotting 实验检测了0、1、3、10、30μmol/L 药物浓度处理A549和H1299细胞48h 后AKT 及其下游分子CREB 磷酸化水平的表达情况，结果显示P-AKT （Ser473）和P-CREB （Ser133）蛋白表达均下调（P <0.05，图4A~D ）。

2.6AKT 激动剂逆转去甲泽拉木醛诱导非小细胞肺癌凋亡的作用
在A549和H1299两株细胞中，单独使用去甲泽拉木醛组（T-96组）的凋亡率高于对照组（P <0.05），与上述实验结果一致，而去甲泽拉木醛与SC79的共处理组（T-96+SC79组）凋亡率明显低于单独使用药物组（T-96组）的凋亡率（P <0.05，图5A~D ）。

Western blotting 结果显示单独使用药物组（T-96组）相比于对照组，Bcl-2表达下调，Bax 、clevaed-caspase3表达上调（P <0.05），与上述实验结果一致，共处理组相较于单独使用药物组（T-96组），Bcl-2表达上调，Bax 、clevaed-caspase3表达下调（P <0.05，图5E~H ）。

3讨论
从天然植物中分离出的生物活性物质中开发新药是降低抗癌药物毒性和提高其抗癌有效性的可行途
径［16］。

从雷公藤中提取的去甲泽拉木醛在结直肠癌［17］
、
肝癌［18］、胃癌［19］
等各种类型的恶性肿瘤中表现出优秀的抗肿瘤活性，但在非小细胞肺癌中的作用少有文献报道。

细胞生长和增殖的不受调控是导致肿瘤发生的重要因素，因此我们首先在研究中通过CCK-8和克隆形成实验验证了去甲泽拉木醛能够抑制A549和H1299细胞的活力和增殖，并且通过流式实验也验证了去甲泽拉木醛对A549和H1299细胞具有诱导凋亡的作用，通过Western blotting 实验发现去甲泽拉木醛能够上调Bax 和clevaed-caspase3表达，下调Bcl-2表达，以上结果说明去甲泽拉木醛在体外能够对肺癌细胞的生长发挥抑制作用，初步证明了去甲泽拉木醛的在NSCLC 中的抗癌作用。

J South Med Univ,2024,44(2):280-288
·
·282
H1299
C e l l c o l o n i e s (n u m b e r )
500450400350300250200150100500
0.10.313
Demethylzeylasteral (μmol/L)
E
C e l l v i a b i l i t y (%)
0.03
0.10.3131030
100
Demethylzeylasteral (μmol/L)
***
A549
24h
48h
120100806040200************
******
******
**图1去甲泽拉木醛抑制非小细胞肺癌细胞增殖
Fig.1T-96inhibits proliferation of NSCLC cells.A ,B :CCK-8assay for assessing the viability of A549and H1299cells treated with 0.03,0.1,0.3,1,3,10,30,and 100μmol/L demethylzeylasteral.C :Clone formation ability of A549and H1299cells treated with 0.1,0.3,1,and 3μmol/L demethylzeylasteral.D ,E :Statistical analysis of the number of clonal spots.F :Demethylzeylasteral causes morphological changes in A549and H1299cells (scar bar=100μm).n =3;**P <0.01,***P <0.001vs 0μmol/L.
T-96(μmol/L)
1
3
10
30
H 1299A 549
C
C e l l c o l o n i e s (n u m b e r )
A549
7006005004003002001000
0.10.313
Demethylzeylasteral (μmol/L)
D
T-96(μmol/L)
1
3
10
30
H 1299A 549
F
A
B
H1299
24h 48h
C e l l v i a b i l i t y (%)
120
100806040200
0.03
0.10.3131030100
Demethylzeylasteral (μmol/L)
***
******
******
***
******
***
*********
***
******
***
**
***
***
***
***
***
J South Med Univ,2024,44(2):280-288
·
·283
B
131030
Demethylzeylasteral (μmol/L)
***
***
**
A549
A p o p t o t i c c e l l s (%)
4035302520151050
C 0
131030
Demethylzeylasteral (μmol/L)
A p o p t o t i c c e l l s (%)
50
454035302520151050
H1299
***
***
**
*
D
T-96(μmol/L)
1
3
10
30
A549M r 25000200002000040000
Bcl-2Bax Cleaved Caspase3β-actin
F
T-96(μmol/L)
1
3
10
30
H1299M r 25000200002000040000
Bcl-2
Bax Cleaved Caspase3β-actin
E
Bcl-2
Bax Cleaved-Caspase3
A549
0131030R e l a t i v e p r o t e i n e x p r e s s i o n
1.81.61.41.21.00.80.60.40.20
******
***
*********
********A
图2去甲泽拉木醛诱导非小细胞肺癌细胞发生凋亡
Fig.2T-96induces apoptosis in NSCLC cells.A -C :Apoptosis of A549and H1299cells treated with 1,3,10and 30μmol/L demethylzeylasteral for 48h detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining.D -G :Western blotting for detecting the expressions of cleaved caspase-3,Bax,and Bcl-2in A549and H1299cells treated with 1,3,10,and 30μmol/L demethylzeylasteral for 48h and quantitative analysis of the relevant proteins levels using Image J.n =3;*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001vs 0μmol/L.
G
0131030H1299
Bcl-2
Bax Cleaved-Caspase3
************
******R e l a t i v e p r o t e i n e x p r e s s i o n
1.81.61.41.21.00.80.60.40.20
***
*
H 1299
A 549
T-96(μmol/L)
1
3
10
30
P I
Annexin-FITC
μmol/L
μmol/L
J South Med Univ,2024,44(2):280-288
·
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T-96(μmol/L)
0.1
0.3
1
A 549
H 1299
48h
0h
48h
0h
图3去甲泽拉木醛抑制NSCLC 细胞的迁移和侵袭并抑制EMT 的发生
Fig.3T-96inhibits migration and invasion and suppresses EMT of NSCLC cells.A -C :Changes in the scratch area of A549and H1299cells treated with 0.1,0.3,and 1μmol/L demethylzeylasteral for 48h and quantitative analysis of the cell migration area using Image J.D ,E :Transwell assay of A549and H1299cells treated with 0.1,0.3,and 1μmol/L demethylzeylasteral for 48h and quantitative analysis of the number of cells crossing the chambers (scar bar=100μm).F -I :Western blotting for detecting the expressions of E-cadherin,N-cadherin,and vimentin in A549and H1299cells treated with 1,3,10,and 30μmol/L demethylzeylasteral for 48h and quantitative analysis of the protein expression levels using Image J.n =3;*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001vs 0μmol/L.
C D
F
T-96(μmol/L)0
1310
30
A549M r
1000001500005000040000
E-cadherin N-cadherin Vimentin
GAPDH
E-cadherin N-cadherin Vimentin GAPDH
1000001500005000040000
T-96(μmol/L)0
1310
30
H1299M r H
B E
A549H1299
I n v a d e d c e l l n u m b e r
250200150100500
***
***
***
***
***Vimentin
N-cadherin
E-cadherin
G
R e l a t i v e p r o t e i n e x p r e s s i o n
1.8
1.61.41.21.00.80.60.40.20
A549
0131030******
***
******
***
*******
*Vimentin N-cadherin E-cadherin
1310
30H1299
R e l a t i v e p r o t e i n e x p r e s s i o n
1.6
1.41.21.00.80.60.40.20
******
***
******
********
*
I
μmol/L
μmol/L
C o v e r a r e a (%)
00.10.31Demethylzeylasteral (μmol/L)
00.10.31Demethylzeylasteral (μmol/L)
H1299A549
100
806040200
C
o v e r a r e a (%)
100
806040200
***
******
***
**
*
T-96(μmol/L)
0.1
0.3
1
H 1299
A 549
A 00.10.31μmol/L
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癌症转移是癌症死亡的主要原因，是肿瘤治疗中主要挑战之一，我们通过划痕实验和Transwell 侵袭实验验证了去甲泽拉木醛在体外能够抑制A549和H1299细胞的迁移和侵袭作用，并且具有浓度依赖性。

研究表明EMT 正在成为肿瘤细胞侵袭和转移的关键决定因素，EMT 是上皮细胞获得侵入细胞外基质的能力，并转分化成间充质细胞的动态过程［20,21］，在转化过程中，E-Cadherin 等上皮基因的表达或功能丢失，而定义间充质表型的基因如Vimentin ，N-cadherin ，纤连蛋白的表达增强［22］。

所以为了进一步解释去甲泽拉木醛抑制肺癌转移的可能机制，我们通过Western blotting 实验检测去甲泽拉木醛对EMT 关键分子的表达的影响，结果显示去甲泽拉木醛能够上调E-cadherin 表达，下调N-cadherin 和Vimentin 表达，可以证明去甲泽拉木醛能够抑制A549和H1299细胞的EMT 过程，这可能是去甲泽拉木醛抑制非小细胞肺癌转移的机制。

PI3K/AKT 通路是癌症中最常被破坏的通路，该通路的激活与实体瘤中细胞增殖、凋亡、血管生成等多种细胞过程有关，为了进一步验证去甲泽拉木醛抑制肺癌细胞增殖和转移是通过影响该通路实现的，我们通过Western blotting 检测了药物作用对AKT 的磷酸化水平的影响，结果显示，随着去甲泽拉木醛的浓度升高，AKT 磷酸化水平被抑制，而总AKT 的表达不受影响，说明去甲泽拉木醛抑制了AKT 的活化。

接着我们使用AKT 激动剂SC79进行回复实验发现，SC79部分逆转了去甲泽拉木醛对肺癌细胞发挥的促进凋亡作用，这说明AKT 的活化在诱导细胞凋亡过程中发挥了重要作用。

靶向肿瘤细胞凋亡途径是种有效的抗癌策略，但是由于健康组织对细胞凋亡也具有一定的敏感性，因此可以选择靶向致癌途径或靶向肿瘤抑制通路诱导凋亡等方式来间接发挥作用，例如靶向AKT 信号途径，有研究证明在NSCLC 肿瘤组织样本中的AKT 阳性率明显高于癌旁组织样本［23］，在NSCLC 基因突变发生率最高的EGFR 突变型NSCLC 中，AKT 的激活可能是在治疗中
对EGFR 抑制剂产生耐药重要原因［24］
，以上均可以说明抑制AKT 的激活在抑制NSCLC 的发生发展以及肿瘤的治疗中起到关键作用。

我们还观察到AKT 的下游分子之一CREB 的磷酸化水平也被药物抑制，且具有浓度依赖性，CREB 调控着上千个下游基因，其中有大量基
因的参与肿瘤的发生与进展［25］
，所以CREB 在肿瘤的发
展、维持、进展中起到核心作用，有研究表明［26］
，在6种不同类型的NSCLC 组织中均检测出CREB 的异常激活，
T-96(μmol/L)
1
310
30
A549M r 5000050000400004000035000
T-AKT P-AKT T-CREB P-CREB GAPDH
A
图4去甲泽拉木醛抑制AKT/CREB 信号通路的发生
Fig.4T-96inhibits the AKT/CREB signaling pathway in A549and H1299cells.The protein expressions of P-AKT/T-AKT and P-CREB/T-CREB were detected using Western blotting and quantitatively analyzed in A549
cells (A ,B )and H1299cells (C ,D )treated with 1,3,10,and 30μmol/L demethylzeylasteral for 48h.n =3;*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001vs 0μmol/L.
M r 5000050000400004000035000
T-AKT P-AKT T-CREB P-CREB GAPDH
T-96(μmol/L)
1310
30
H1299C
0131030H1299
***
***
***
***
***
*
P-AKT/T-AKT
P-CREB/T-CREB
R e l a t i v e p r o t e i n e x p r e s s i o n
1.6
1.41.21.00.80.60.40.20
D A549
0131030***
***
***
***
***
**
**
P-AKT/T-AKT P-CREB/T-CREB
R e l a t i v e p r o t e i n e x p r e s s i o n
3.02.52.01.51.00.50
B
μmol/L
μmol/L
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