几种真菌DNA提取方法的比较
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图 2 提取物 DNA 的扩增产物电泳图
3 讨论 实验发现直接从平板上刮菌丝的方法简单方便，
但是得率偏低，尤其是对于那些菌丝不发达的菌株，而 发酵虽然耗费点时间，但过滤得到的菌体既丰富又易 于研磨，DNA 产量很高。对于沉淀 DNA，异戊醇明显 优于无水乙醇，可以减少 DNA 的损耗。加 PVP(聚乙烯 吡咯烷酮)可减少酚类、醌类及丹宁类物质的影响 。 [9] DNA 提取过程中，最常见的问题是多糖和蛋白的污 染，CTAB 既能裂解细胞，又能有效地沉淀多糖，而适 量加点蛋白酶 K 则可去除蛋白质污染。如果想得到漂 亮的 DNA 条带，可以在检测前向 DNA 中加入适量的 蛋白酶 K，水浴一段时间，再检测，蛋白就会被消灭的 干干净净。CTAB 浓度以 3%为最佳，既能有效除去多 糖等杂质，又易于提纯时与 DNA 分开，不造成额外污 染。SDS 法操作简单、温和，也可提取到高分子量的 DNA，但所得到的产物含糖类杂质较多。
各样品吸取 5 μl 进行电泳，结果显示，三种方法都 可以获得目的 DNA，而且得率都挺高，分子量在 23 kb 左右。CTAB 法提取的 DNA 条带很亮，得率高，但有 降解现象。在提取 DNA 时，已经加入了 RNase 处理， 但是在琼脂糖凝胶的最前端具有明显的亮带，可能是 杂蛋白、DNA 碎片或未消化掉的 RNA。SDS 法提取的 DNA 条带也比较亮，而且也存在杂蛋白，但是完全可 以用于 PCR 扩增。改良的 CTAB 法提取的 DNA 条带 很亮，得率很高，而且凝胶前端的 DNA 碎片或 RNA 带 几乎没有，而且将提取与纯化合二为一，简化了步骤， 但同时也耗费最多。进一步用紫外分光光度计检测经 改良的 CTAB 法所提取的 DNA 质量，其 A /A 260 280比值在 1.80 左右，说明 DNA 纯度很高。
中国农学通报 2009,25(08):62-64 Chinese Agricultural Science Bulletin
几种真菌 DNA 提取方法的比较
吴发红，黄东益，黄小龙，周 鑫，程文杰
(海南大学农学院，海南儋州 571737)
摘 要：通过 3 种内生真菌 DNA 提取方法的比较，即 CTAB 法、SDS 法、改良的 CTAB 法，结果表明三种方 法都能得到目的 DNA，而且得率都较好，但改良的 CTAB 法效果最好，不仅 DNA 纯度高且质量也好。用 改良的 CTAB 法所提取的 DNA 作为模板，进行 PCR 扩增，得到了清晰的、单一的扩增普带，完全可用于 酶切、测序等后续实验。 关键词：内生；DNA 提取；CTAB；SDS 中图分类号：S812 文献标识码：A
法等。目前国内外开发了多种商品化的 DNA 提取纯 化试剂盒，其分离原理有的利用核酸的分子量差异，有 的利用特异性膜与 DNA 结合达到分离、回收的目的， 如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料 来源设计了不同的提取方法,操作简单、高效，DNA 质 量较高，但价格昂贵，提取量少，实际应用的比较少。 目 前 ，氯 化 苄 、酶 [11] 解 法 、十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 (CTAB)法、十二烷基磺酸钠（SDS）法，尤其是后两种 方法，因为无需昂贵仪器和药品，提取的 DNA 纯度能 够满足一般分子生物学的需要[1]，在真菌 DNA 提取中 应用较广泛。
M
MM
A
B
C
图 1 三种方法提取的内生真菌 DNA
A:CTAB 法；B:SDS 法；C:改良的 CTAB 法
2.2 PCR 扩增的结果 以改良的 CTAB 法所提取出的 DNA 为模板，采用
真菌内转录间隔区通用引物 ITS1/ITS4 做 PCR，marker
为 100 bp ladder，产物经电泳后 GoldView 染色，在紫外 光下见 DNA 条带清晰，且无非特异性扩增条带，分子 量在 500~700 bp（图 2）。
真菌的分类鉴定过去一般采用的是形态学方法， 主要按照真菌的形态、生理生化特点、抗原构造等特征 加以区分。但真菌种类众多、个体多态性明显，常会得 出假阳性或假阴性结果，因此鉴定结果不是很准确 。 [1] 近年来，随着分子生物学的发展，其在真菌分类学中发 挥了越来越大的作用，rDNA 序列分析被广泛使用。 要 进 行 DNA 序 列 分 析 ，就 需 要 用 PCR 扩 增 特 定 的 DNA 片段，而 DNA 提取则是这项工作的基础。因此 找出一种快速且得率高的方法就显得很重要。笔者通 过几种 DNA 提取方法的比较[2-3]，得到一种较好的提取 真菌 DNA 的方法。 1 材料和方法 1.1 菌株来源
一般认为所提取 DNA 经紫外分光光度计检测时， 其 A /A 260 280比值在 1.80 左右说明 DNA 纯度最高，若该值 小于 1.80 说明所提取的 DNA 含蛋白质较高，大于 2.0 则说明 RNA 未抽提干净。由此可见改良的 CTAB 法 所提取的各菌株 DNA，其质量是很高的。
真菌 DNA 的提取方法很多，其区别主要在于破壁 方法以及破壁后分离核酸、蛋白质方面的不同，但均包 括真菌细胞壁的裂解，真菌细胞膜的破坏，达到 DNA 的释放以及真菌的纯化步骤。传统的破壁包括机械破 壁、超声波破壁、玻璃珠破壁[10]。核酸分离方法包括经 典的酚、氯仿抽提，以及商品化的纯化柱、纯化膜分离
质量分数为 0.8%的琼脂糖凝胶中，在电泳缓冲液 为 1 × TBE ，电 压 为 90 V 的 条 件 下 电 泳 40 min，用 GoldView 染色，在凝胶成像仪上观察 DNA 分子的大 小、完整性及电泳条带的清晰度，进行拍照。 1.6 PCR 扩增
模板 DNA 0.8 μl，引物 1 和引物 2 各 0.6 μl，2×Taq PCR MasterMix 7.5 μl，加 ddH2O 至 15 μl 的体系。扩 增程序[8]为：94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 40 s，37 ℃ 退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，72 ℃后延伸 10 min，40 个 循环。质量分数为 2%的琼脂糖凝胶于 5 V/cm 的电场 中进行电泳，经 GoldView 染色后，于凝胶成像系统上 观察拍照。 2 结果与分析 2.1 对 6 株菌株进行 DNA 提取的结果见图 1-A、B、C：
SDS 法： 参照傅骏华等[6]和杨潇远等[7]方法。取 200 mg 菌 体，液氮研磨，加入 400 μl SDS 提取缓冲液；65 ℃水浴 45 min，13000 r/min 离心 5 min；取上清转到离心管中， 加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）；摇匀，离心 5 min， 取上清，加等体积的氯仿/异戊醇；摇匀，离心 3 min，取 上清，加入 2 倍体积的无水乙醇和 2 mol/L NaCl，-20 ℃ 沉淀 30 min，12 000 r/min 离心 20 min；去上清，70%酒 精冲洗，超净工作台倒置进行真空干燥；加 500 μl TE， 加 2 μl 的 RNA 酶，37 ℃水浴 1 h；加入 800 μl 氯仿/异戊 醇（24∶1），12000 r/min 离心 10 min，重复 2 次，余下的步 骤和 CTAB 相同。 改良的 CTAB 法： 取200 mg菌体，液氮研磨，加入3 ml 3% CTAB提取 缓冲液；65 ℃水浴45 min，40 ℃ 4000 r/min离心20 min； 取上清转到离心管中，加入 4 μl 10 mg/ml 蛋白酶，37 ℃ 水浴 1 h；加入 800 μl Tris 饱和酚，摇匀，13000 r/min 离 心 10min；取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，摇匀，
2×Taq PCR MasterMix 和蛋白酶 K 购于上海天根 生物公司，CTAB，SDS，DNA-marker、GoldView 购于上 海生工生物公司，引物 1（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAAC CTGCGG-3'）和引物 2（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3'）由上海英骏生物技术有限公司合成。
13000 r/min 离心 10 min；取上清，加 10 mg/ml 的 RNA 酶，37 ℃水浴过夜处理；加入 800 μl 氯仿/异戊醇，摇 匀 ，13000 r/min 离 心 10 min；取 上 清 ，加 600 μ l 异 戊 醇，-20 ℃沉淀 30 min，余下步骤同上。 1.5 DNA 样品的检测
Abstract: In this study, three different methods were used to extract DNA from endophytic fungi: CTAB,SDS and the improved CTAB. Quality and quantity of the extracted DNA were compared for the there methods. The results showed that all of the there methods could obtain the DNA, but the improved CTAB could obtain the highest quantity of the purest fungal DNA. The purest DNA was amplified by PCR .The clear and singal gel fragment showed that the extracted DNA could be used for the other biological experiments. Key words: endophytic, DNA extraction, CTAB, SDS
该研究所使用的菌株是由海南大学农学院提供
1.2 菌株的培养与收集 将真菌孢子接种到 PDA 平板上活化培养 2~3 天，
温度 25 ℃，光照 12L∶12D。 两种方法收集菌丝：一种是当菌丝长满培养基表
面并未产孢时，直接从平板上刮取菌丝；另一种是从平 板上挑菌饼到液体 PDA 培养基中，28 ℃ 180 r/min 震 荡培养 5~7 天，真空抽滤，收集干燥的菌丝。 1.3 主要试剂
Comparing Study on several Methods for DNA Extraction from endophytic fungi
Wu Fahong, Huang Dongyi, Huang Xiaolong, Zhou Xin, Cheng Wenjie
（Academy of Agriculture, Hainan University, Danzhou Hainan 571737）
吴发红等：几种真菌 DNA 提取方法的比较
· 63 ·
1.4 DNA 提取方法 CTAB 法： 参照 Guo 等[4（] 2000）和 Saghai 等[5]的方法。取少
许新鲜菌体，加液氮研磨，加入 3 ml 2%CTAB(加 PVP)， 装管；65 ℃水浴 45 min，13000 r/min 离心 10 min；取上 清（水相）于一新离心管中，加等体积的酚/氯仿/异戊 醇（25∶24∶1），12000 r/min 离心 10 min；取上清，加等体 积的氯仿/异戊醇（24∶1），12000 r/min 离心 10 min；取 上 清 ，加 2 L 的 无 水 乙 醇 和 NaCl 溶 液 ，-20 ℃ 沉 淀 30 min，12 000 r/min 离心 20 min；收集沉淀，75%酒精 冲洗，超净台真空干燥；100 μl TE 溶解 DNA，-20 ℃保 存 备 用 。 加 入 1 μl 的 RNA 酶 ，37 ℃ 水 浴 1 h；加 入 400 μl 氯仿/异戊醇（24∶1），12000 r/min 离心 10 min，重 复 2 次。
第一作者简介：吴发红，女，1982 年出生，安徽省池州市人，研究生。研究方向：分子生物学。通信地址：571737 海南大学（儋州校区）农学院，E-mail： fafa-139@。 通讯作者：黄东益，男，1969 年出生，云南宣威人，教授，研究方向：水稻、甘蔗等作物的分子标记育种与分子细胞遗传学，微生物学。通信地址： 571737 海南大学（儋州校区）农学院，E-mail: hdongyi123@ 收稿日期：2009-02-18，修回日期：2009-3-3。
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图 2 提取物 DNA 的扩增产物电泳图
3 讨论 实验发现直接从平板上刮菌丝的方法简单方便，
但是得率偏低，尤其是对于那些菌丝不发达的菌株，而 发酵虽然耗费点时间，但过滤得到的菌体既丰富又易 于研磨，DNA 产量很高。对于沉淀 DNA，异戊醇明显 优于无水乙醇，可以减少 DNA 的损耗。加 PVP(聚乙烯 吡咯烷酮)可减少酚类、醌类及丹宁类物质的影响 。 [9] DNA 提取过程中，最常见的问题是多糖和蛋白的污 染，CTAB 既能裂解细胞，又能有效地沉淀多糖，而适 量加点蛋白酶 K 则可去除蛋白质污染。如果想得到漂 亮的 DNA 条带，可以在检测前向 DNA 中加入适量的 蛋白酶 K，水浴一段时间，再检测，蛋白就会被消灭的 干干净净。CTAB 浓度以 3%为最佳，既能有效除去多 糖等杂质，又易于提纯时与 DNA 分开，不造成额外污 染。SDS 法操作简单、温和，也可提取到高分子量的 DNA，但所得到的产物含糖类杂质较多。
各样品吸取 5 μl 进行电泳，结果显示，三种方法都 可以获得目的 DNA，而且得率都挺高，分子量在 23 kb 左右。CTAB 法提取的 DNA 条带很亮，得率高，但有 降解现象。在提取 DNA 时，已经加入了 RNase 处理， 但是在琼脂糖凝胶的最前端具有明显的亮带，可能是 杂蛋白、DNA 碎片或未消化掉的 RNA。SDS 法提取的 DNA 条带也比较亮，而且也存在杂蛋白，但是完全可 以用于 PCR 扩增。改良的 CTAB 法提取的 DNA 条带 很亮，得率很高，而且凝胶前端的 DNA 碎片或 RNA 带 几乎没有，而且将提取与纯化合二为一，简化了步骤， 但同时也耗费最多。进一步用紫外分光光度计检测经 改良的 CTAB 法所提取的 DNA 质量，其 A /A 260 280比值在 1.80 左右，说明 DNA 纯度很高。
中国农学通报 2009,25(08):62-64 Chinese Agricultural Science Bulletin
几种真菌 DNA 提取方法的比较
吴发红，黄东益，黄小龙，周 鑫，程文杰
(海南大学农学院，海南儋州 571737)
摘 要：通过 3 种内生真菌 DNA 提取方法的比较，即 CTAB 法、SDS 法、改良的 CTAB 法，结果表明三种方 法都能得到目的 DNA，而且得率都较好，但改良的 CTAB 法效果最好，不仅 DNA 纯度高且质量也好。用 改良的 CTAB 法所提取的 DNA 作为模板，进行 PCR 扩增，得到了清晰的、单一的扩增普带，完全可用于 酶切、测序等后续实验。 关键词：内生；DNA 提取；CTAB；SDS 中图分类号：S812 文献标识码：A
法等。目前国内外开发了多种商品化的 DNA 提取纯 化试剂盒，其分离原理有的利用核酸的分子量差异，有 的利用特异性膜与 DNA 结合达到分离、回收的目的， 如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料 来源设计了不同的提取方法,操作简单、高效，DNA 质 量较高，但价格昂贵，提取量少，实际应用的比较少。 目 前 ，氯 化 苄 、酶 [11] 解 法 、十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 (CTAB)法、十二烷基磺酸钠（SDS）法，尤其是后两种 方法，因为无需昂贵仪器和药品，提取的 DNA 纯度能 够满足一般分子生物学的需要[1]，在真菌 DNA 提取中 应用较广泛。
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图 1 三种方法提取的内生真菌 DNA
A:CTAB 法；B:SDS 法；C:改良的 CTAB 法
2.2 PCR 扩增的结果 以改良的 CTAB 法所提取出的 DNA 为模板，采用
真菌内转录间隔区通用引物 ITS1/ITS4 做 PCR，marker
为 100 bp ladder，产物经电泳后 GoldView 染色，在紫外 光下见 DNA 条带清晰，且无非特异性扩增条带，分子 量在 500~700 bp（图 2）。
真菌的分类鉴定过去一般采用的是形态学方法， 主要按照真菌的形态、生理生化特点、抗原构造等特征 加以区分。但真菌种类众多、个体多态性明显，常会得 出假阳性或假阴性结果，因此鉴定结果不是很准确 。 [1] 近年来，随着分子生物学的发展，其在真菌分类学中发 挥了越来越大的作用，rDNA 序列分析被广泛使用。 要 进 行 DNA 序 列 分 析 ，就 需 要 用 PCR 扩 增 特 定 的 DNA 片段，而 DNA 提取则是这项工作的基础。因此 找出一种快速且得率高的方法就显得很重要。笔者通 过几种 DNA 提取方法的比较[2-3]，得到一种较好的提取 真菌 DNA 的方法。 1 材料和方法 1.1 菌株来源
一般认为所提取 DNA 经紫外分光光度计检测时， 其 A /A 260 280比值在 1.80 左右说明 DNA 纯度最高，若该值 小于 1.80 说明所提取的 DNA 含蛋白质较高，大于 2.0 则说明 RNA 未抽提干净。由此可见改良的 CTAB 法 所提取的各菌株 DNA，其质量是很高的。
真菌 DNA 的提取方法很多，其区别主要在于破壁 方法以及破壁后分离核酸、蛋白质方面的不同，但均包 括真菌细胞壁的裂解，真菌细胞膜的破坏，达到 DNA 的释放以及真菌的纯化步骤。传统的破壁包括机械破 壁、超声波破壁、玻璃珠破壁[10]。核酸分离方法包括经 典的酚、氯仿抽提，以及商品化的纯化柱、纯化膜分离
质量分数为 0.8%的琼脂糖凝胶中，在电泳缓冲液 为 1 × TBE ，电 压 为 90 V 的 条 件 下 电 泳 40 min，用 GoldView 染色，在凝胶成像仪上观察 DNA 分子的大 小、完整性及电泳条带的清晰度，进行拍照。 1.6 PCR 扩增
模板 DNA 0.8 μl，引物 1 和引物 2 各 0.6 μl，2×Taq PCR MasterMix 7.5 μl，加 ddH2O 至 15 μl 的体系。扩 增程序[8]为：94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 40 s，37 ℃ 退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，72 ℃后延伸 10 min，40 个 循环。质量分数为 2%的琼脂糖凝胶于 5 V/cm 的电场 中进行电泳，经 GoldView 染色后，于凝胶成像系统上 观察拍照。 2 结果与分析 2.1 对 6 株菌株进行 DNA 提取的结果见图 1-A、B、C：
SDS 法： 参照傅骏华等[6]和杨潇远等[7]方法。取 200 mg 菌 体，液氮研磨，加入 400 μl SDS 提取缓冲液；65 ℃水浴 45 min，13000 r/min 离心 5 min；取上清转到离心管中， 加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）；摇匀，离心 5 min， 取上清，加等体积的氯仿/异戊醇；摇匀，离心 3 min，取 上清，加入 2 倍体积的无水乙醇和 2 mol/L NaCl，-20 ℃ 沉淀 30 min，12 000 r/min 离心 20 min；去上清，70%酒 精冲洗，超净工作台倒置进行真空干燥；加 500 μl TE， 加 2 μl 的 RNA 酶，37 ℃水浴 1 h；加入 800 μl 氯仿/异戊 醇（24∶1），12000 r/min 离心 10 min，重复 2 次，余下的步 骤和 CTAB 相同。 改良的 CTAB 法： 取200 mg菌体，液氮研磨，加入3 ml 3% CTAB提取 缓冲液；65 ℃水浴45 min，40 ℃ 4000 r/min离心20 min； 取上清转到离心管中，加入 4 μl 10 mg/ml 蛋白酶，37 ℃ 水浴 1 h；加入 800 μl Tris 饱和酚，摇匀，13000 r/min 离 心 10min；取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，摇匀，
2×Taq PCR MasterMix 和蛋白酶 K 购于上海天根 生物公司，CTAB，SDS，DNA-marker、GoldView 购于上 海生工生物公司，引物 1（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAAC CTGCGG-3'）和引物 2（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3'）由上海英骏生物技术有限公司合成。
13000 r/min 离心 10 min；取上清，加 10 mg/ml 的 RNA 酶，37 ℃水浴过夜处理；加入 800 μl 氯仿/异戊醇，摇 匀 ，13000 r/min 离 心 10 min；取 上 清 ，加 600 μ l 异 戊 醇，-20 ℃沉淀 30 min，余下步骤同上。 1.5 DNA 样品的检测
Abstract: In this study, three different methods were used to extract DNA from endophytic fungi: CTAB,SDS and the improved CTAB. Quality and quantity of the extracted DNA were compared for the there methods. The results showed that all of the there methods could obtain the DNA, but the improved CTAB could obtain the highest quantity of the purest fungal DNA. The purest DNA was amplified by PCR .The clear and singal gel fragment showed that the extracted DNA could be used for the other biological experiments. Key words: endophytic, DNA extraction, CTAB, SDS
该研究所使用的菌株是由海南大学农学院提供
1.2 菌株的培养与收集 将真菌孢子接种到 PDA 平板上活化培养 2~3 天，
温度 25 ℃，光照 12L∶12D。 两种方法收集菌丝：一种是当菌丝长满培养基表
面并未产孢时，直接从平板上刮取菌丝；另一种是从平 板上挑菌饼到液体 PDA 培养基中，28 ℃ 180 r/min 震 荡培养 5~7 天，真空抽滤，收集干燥的菌丝。 1.3 主要试剂
Comparing Study on several Methods for DNA Extraction from endophytic fungi
Wu Fahong, Huang Dongyi, Huang Xiaolong, Zhou Xin, Cheng Wenjie
（Academy of Agriculture, Hainan University, Danzhou Hainan 571737）
吴发红等：几种真菌 DNA 提取方法的比较
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1.4 DNA 提取方法 CTAB 法： 参照 Guo 等[4（] 2000）和 Saghai 等[5]的方法。取少
许新鲜菌体，加液氮研磨，加入 3 ml 2%CTAB(加 PVP)， 装管；65 ℃水浴 45 min，13000 r/min 离心 10 min；取上 清（水相）于一新离心管中，加等体积的酚/氯仿/异戊 醇（25∶24∶1），12000 r/min 离心 10 min；取上清，加等体 积的氯仿/异戊醇（24∶1），12000 r/min 离心 10 min；取 上 清 ，加 2 L 的 无 水 乙 醇 和 NaCl 溶 液 ，-20 ℃ 沉 淀 30 min，12 000 r/min 离心 20 min；收集沉淀，75%酒精 冲洗，超净台真空干燥；100 μl TE 溶解 DNA，-20 ℃保 存 备 用 。 加 入 1 μl 的 RNA 酶 ，37 ℃ 水 浴 1 h；加 入 400 μl 氯仿/异戊醇（24∶1），12000 r/min 离心 10 min，重 复 2 次。
第一作者简介：吴发红，女，1982 年出生，安徽省池州市人，研究生。研究方向：分子生物学。通信地址：571737 海南大学（儋州校区）农学院，E-mail： fafa-139@。 通讯作者：黄东益，男，1969 年出生，云南宣威人，教授，研究方向：水稻、甘蔗等作物的分子标记育种与分子细胞遗传学，微生物学。通信地址： 571737 海南大学（儋州校区）农学院，E-mail: hdongyi123@ 收稿日期：2009-02-18，修回日期：2009-3-3。