基因工程(基因工程的主要技术与原理分子杂交技术)

通过放射自显影或生化检测， 就可判断滤膜上是否存在与探针 同源的DNA分子及其分子量。
Southern杂交主要用来判断某 一生物样品中是否存在某一基因， 以及该基因所在的限制性酶切片 段的大小。（DNA水平）
Southern杂交也可检测目的基 因的拷贝数。
CK 1 2 3 4 5
Southern bloting
这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面 可以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以 检测出目标蛋白质的分子量，从而直观的在滤膜上显 示出目标蛋白。
五、Dot blot hybridization
1、原理：
在Southern杂交的基础上发展起来的用于 快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸 样品直接转移到适当的滤膜上，然后进行杂 交检测。
凝胶
3）转移并固定到滤膜上
通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝 胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后 通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。
Southern blotting 装置示意图
4）探针的制备及杂交
预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预 杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜 本身对探针的吸附。
当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交, 便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分 子具有同源性的核酸分子。这个标记的核酸 分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以 是RNA，或合成的寡核苷酸。
二、基本过程
1、核酸印迹（Nucleic acid blotting): 将核酸样品（DNA、RNA或蛋白质）在凝胶
在1975年，由英国的E. Southern首先设计发明的， 因此又称为Southern杂交（Southern blotting)。
2、特点：
❖ 作用对象：DNA分子 ❖ DNA片段需经凝胶电泳分离 ❖ 固相支持物：可选用的滤膜种类较多 ❖ 灵敏度高
3、基本过程：
DNA的片段化及其电泳分离 凝胶电泳后的变性处理 转移并固定到滤膜上 杂交 检测与分析
将该片段标记后与样品核酸进行分子杂交， 通过检测标记核酸的存在从而判断样品中特定 核酸片段的存在。
用作检测的核酸片段即为探针（probe）。
1.均匀标记 间接标记不是标记探针分子本身，而是复制一段 新的探针分子，在复制过程中掺入标记的核苷酸 (如[α- 32 P]dATP)，从而使整个新分子被均匀 地标记。
2、优点：
❖ 快速简便，不需电泳分离 ❖ 一次的检测量大 ❖ 更适用于定量检测
Dot blot hybridization
六、菌落或噬菌斑杂交
(Colony or plaque blot hybridization)
1、原理：
将菌落或噬菌斑直接转移到滤膜上，使溶菌变性的 DNA同滤膜原位结合，然后进行杂交检测。
三、Northern blot hybridization
1、原理：
根据毛细管作用的原理，使在凝胶电泳中已分 离的RNA转移并结合到适当的滤膜上，然后通过 同已标记的单链DNA或RNA探针进行杂交，以检测 被转移RNA片段，称为RNA印迹杂交技术。
在1979年，由J. C. Alwine等人设计。也称 为Northern杂交（Northern blotting)。
The Southern blotting technique
25M 27 29 M 31 33 35 M 37 39 M 41 43 M
1）DNA的片段化及其电泳分离
2）凝胶电泳后的变性处理
➢在0.4N NaOH碱性条件下变性，使 双链DNA分子变成单链。 ➢再在1.5M NaCl/1M Tris（pH7.4） 条件下中和使DNA仍保持单链状态。
2.末端标记 直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素 原子，或直接在探针分子上加入标记的原子或复 合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进 行标记，亦称末端标记。
标记与目的序列同源的核苷酸片段作为探针；
探针
杂交：在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸
探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同 源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而 吸在滤膜上。
65C杂交12-16hr

安装杂交管
杂交炉
洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。
5）检测与分析
上分离，然后将样品通过影印的方式转移到固 相支持物如滤膜上。
2、核酸杂交（Hybridization): 将已印迹有核酸样品的滤膜同带有放射性标
记或其它标记的DNA或RNA探针(Probe)进行杂交。
3、结果检测（Detection Results): 通过放射自显影或显色反应，判断样品中是
否有与探针同源的核酸分子或与抗体反应的蛋白 质分子。
杂后根据杂交信号及其相对应的菌落或噬菌斑的位 置，杂交便可从大量菌落或噬菌斑中筛选出含有目标 序列（与探针同源）的菌落或噬菌斑。所以，有时也 称为菌落（或噬菌斑）原位杂交(In situ hybridization)。
菌落或噬菌斑杂交
七、探针的标记
在一个核酸样品中查找是否存在某一特定序 列的分子可用分子杂交来检测，但首先要有一 段与目标核酸分子的序列同源的核酸片段。
其杂交的信号比菌落杂交和噬菌斑杂交受到蛋白质 等细胞成分的干扰小，其结果的可靠性更强。当核酸 分子的斑点面积变得更小，在单位面积滤膜上处理的 样品数量就更多，当检测的灵敏度进一步提高后，就 发展成DNA芯片。
使用特殊的加样装置——多孔过滤进样器，可使众 多待测样品一次同步转移到一张膜上，并有规律地排 列成点阵，所以称为斑点印迹杂交（Dot blot)。
其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交，而是通过 抗体(探针)以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体 识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是DNA 或RNA， 而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。
2、特点：
Western杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否 存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水 平上某基因是否表达。（翻译水平）
核酸印迹的方式：
➢电泳凝胶核酸印迹法(Southern/Northern blot) ➢斑点印迹法(Dot blot) ➢菌落或噬菌斑印迹法(Colony/Plaque blot)
三、Southern blot hybridization
1、原理：
通过毛细管作用、电转移、真空转膜等方法，使在 凝胶电泳中已分离的DNA片段转移并结合到适当的滤膜 上，然后通过同已标记的单链DNA或RNA探针进行杂交， 以检测被转移DNA片段，称为DNA印迹杂交技术。
➢根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、 Northern杂交和Western杂交，以及由此而简 化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。
一、基本原理
➢带有互补核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们 混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成 双链的结构，形成杂种核酸分子。
能形成杂种分 子的不同DNA或 RNA分子，其亲缘 关系较为密切，反 之其亲缘关系则比 较疏远。
2、特点：
❖ 作用对象：RNA分子 ❖ 需经凝胶电泳分离 ❖ 固相支持物：尼龙膜为主，结合牢固程度高 ❖ 主要用于基因表达的检测(RNA水平)
四、Western blot hybridization
1、原理：
Western 杂交的总体过程也与 Southern 杂交相似， 只不过在Blotting过程中转移的是蛋白质而不是 DNA， 这种将蛋白质样品从SDS-PAGE凝胶通过电转移方式转 移到滤膜的方法，称为Western blotting 。
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基因工程
3. 基因工程的主要技术及原理
A 核酸的分离和纯化 B 核酸电泳 C 分子杂交技术 D DNA核苷酸序列分析 E 基因的化学合成 F PCR技术
第三节 分子杂交技术 (molecular hybridization technique)
➢分子杂交:是分子克隆中的一类核酸和蛋白质 分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子 或蛋白质分子是否存在，以及其分子量的大小。