生物反应器培养动物细胞在病毒疫苗生产中的应用

生物反应器培养动物细胞在病毒疫苗生
产中的应用
摘要：病毒传染会对人们的生活造成重大影响，疫苗是控制传染的重要手段。

改进病毒规模化生产效率，优化疫苗生产工艺是病毒疫苗研制的关键环节。

目前，国内动物细胞制备病毒疫苗的操作方式逐渐从转瓶培养向生物反应器培养转变。

生物反应器培养动物细胞的常见方法有悬浮培养、微载体培养、片状载体培养等。

生物反应器培养动物细胞有很多优势，可扩大病毒产量，降低成本，易于获取稳
定性强、免疫原性高的病毒，有助于机械化控制。

生物反应器有潮汐式生物反应器、一次性摇动式生物反应器、一次性填充床生物反应器、微小型生物反应器、
新型固定床生物反应器，不同的反应器有不同的特点。

对生物反应器培养动物细
胞技术在病毒疫苗生产应用领域的研究进行综述，为促进生物反应器的开发与研
究提供参考。

关键词：生物反应器；培养动物细胞；病毒疫苗；生产应用
引言
由病毒引起的传染性疾病严重威胁人类的健康和生命，尤其是某些病毒感染
引起的传染病传播速度快、致死率高，一旦暴发，将对社会造成不可估量的危害。

疫苗是预防传染性疾病最有效的手段之一，使得许多传染性疾病得到有效控制。

但是近几十年，一些致命的新发突发病毒的出现，短时间内难以控制。

疫苗以源
于有关病原体或生物合成抗原为主要成分，其目的是激发免疫反应，以保护机体
免受感染，例如天花病毒疫苗、脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗等，对于病毒性疾病
的防治或消除具有十分重要的意义。

因此，如何制备具有高度特异性且高活性的
新型疫苗就成了当前研究热点之一。

但是传统的疫苗策略，如灭活疫苗和减毒活
疫苗，在某些长期慢性疾病或复发性感染的疾病上性能较差，这些疫苗不仅不能
对患者提供持续有效的保护，甚至会引起严重不良反应。

此外，由于传统疫苗研
发过程周期较长，难以在短期内有效应对埃博拉病毒、寨卡病毒和尼帕病毒等高
致命病原体导致的暴发性大流行。

因此，研发新型疫苗来替代传统疫苗尤为重要。

1动物细胞培养技术
动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织分散成单细胞悬液,然后置于
类似于体内的生存环境中进行培养,使其生存、生长并维持其原有结构与功能的
方法。

体外培养动物细胞能够方便地控制实验因素,观测实验结果,简化了细胞的
生长环境,能够实现规模化生产等。

随着时间的推移,很多学者相继从培养器材、
培养液以及培养方法等方面进行改进,先后出现了试管、培养瓶、培养皿和多孔
培养板等,目前已经从二维细胞培养发展到三维培养。

三维培养体系在空间上为
细胞生长提供了类似体内生长环境的支架或基质,同时细胞相互之间的连接建立
了细胞间及细胞与细胞外基质间的联系,更接近于复杂的体内环境,是动物细胞培
养技术的革新。

现在,动物细胞培养已成为基因工程、细胞工程、抗体工程等生
物技术的重要手段,广泛应用于现代医学和生物科学研究之中。

2传统疫苗的现状和限制
目前，用于病毒性疾病防治的疫苗可分为全病毒疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗等，不同种类的疫苗均有优劣。

全病毒疫苗包括灭活病毒疫苗和减毒活病毒疫苗两大类。

相较于减毒活疫苗，灭活病毒疫苗更易研发且更加安全，对于某些特殊人群如孕妇、免疫功能低下者
提倡选择使用灭活疫苗。

但是灭活疫苗主要引起体液免疫，提供保护的时间也很短，而且需要佐剂以刺激先天免疫反应进而诱导适应性免疫反应。

例如，批准使
用的三价灭活裂解流感疫苗（IIV3）和四价灭活裂解流感疫苗（IIV4）需在高发
季节每年接种。

减毒活病毒疫苗（Liveattenuatedvaccines，LAV）则会诱导强大、持久的体液和细胞免疫反应，同时还可以通过刺激黏膜免疫系统发挥抗感染
功能。

目前，该类疫苗投入临床使用的有针对麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒疫苗等。

但是多数病原体难以找到低毒性的病毒株，体外传代的培养方法虽也能达到减毒
的目的，但周期漫长且毒株的安全性仍有待商榷。

因此，LAV面临的最重要的问
题就是其安全性和有效性之间的权衡。

随着重组DNA技术的发展和蛋白生产的规模化，基于致病病原体抗原的亚单
位疫苗快速发展。

亚单位疫苗相对传统的全病毒疫苗更加安全，但其免疫原性较
弱难以刺激有效、持久的免疫反应。

所以，亚单位疫苗一般与佐剂联合使用，从
而有效的激活免疫反应。

亚单位疫苗因其具有高稳定性、高安全性以及有效性等
优势在病毒疫苗研发上得到了广泛使用。

赛诺菲开发的针对人巨细胞病毒的gB
亚单位疫苗以MF59为佐剂，在一项临床II期试验中显示能够降低50%原发性巨
细胞病毒感染的发病率。

核酸疫苗是一类新型的基因工程生物制品，包括DNA疫苗和RNA疫苗，具有
研发周期短、病毒载体简单、制备方便等特点，几乎能够表达任何蛋白。

DNA疫
苗具有热稳定性好、易于设计、生产迅速、低成本、较少的非特异性炎症等特征。

这对于通常在缺少制冷设备的偏远地区流行的丝状病毒等病毒引起的传染性疾病
来说，或是最佳的选择。

另外，DNA疫苗还具有可组合的特点，例如埃博拉病毒
和马尔堡病毒等的密码子优化糖蛋白基因组合可以控制同类别中多种病毒的感染，这些优势使得其成为研究开发新型疫苗中不可或缺的手段。

但是，DNA疫苗在早
期临床试验中因免疫原性较弱而受到了限制，且需要借助体内电穿孔才能促进核
内传递。

此外，因DNA疫苗存在不良基因组整合事件的风险，且有研究证实电穿
孔增加了DNA疫苗发生不良整合事件的机率，从而推动了核酸疫苗的研究偏向RNA疫苗。

RNA疫苗不存在潜在的基因组整合风险，也不需要体内电穿孔等繁杂
的过程，所以具有更佳的安全性，现今以mRNA为主。

迄今为止，已有20多种基
于mRNA的候选药物进入临床试验阶段。

但与此同时，RNA疫苗也存在许多潜在的
缺点，例如低稳定性、易降解性、体内输送效率低下以及过度产生炎症反应等，
使研发过程面临着巨大挑战。

病毒载体疫苗是指利用基因工程技术，把病毒特定抗原基因序列整合到不同
种类病毒载体的基因组中，一旦重组病毒进入体内，通过感染宿主细胞表达病毒
特定抗原，由此诱导特定的抗病毒先天免疫反应和适应性免疫反应。

该类疫苗具
有能在机体内表达任何外来抗原，并且允许受感染细胞合成新蛋白质，促使内源
性抗原的表达和呈递作用，同时诱导体液和细胞免疫反应，在较短的时间诱发强
大而持久的免疫反应等优势。

此外，病毒载体疫苗还可以用于进一步构建多价疫
苗或多组分疫苗，从而缩短疫苗产品开发时间，简化疫苗接种过程，并改善不同
基因型病毒株之间的交叉保护作用。

目前，已有多种病毒载体疫苗作为潜在的候选疫苗在应对流感、乙型肝炎、艾滋病、新冠肺炎、埃博拉出血热等中发挥至关重要的作用。

由于大多数病毒本身具有致病性活在人体内存有预存抗体，因此该类疫苗有致病性和有效性欠佳的风险。

3生物反应器培养动物细胞的常见方法
3.1悬浮培养
悬浮培养条件单一且具备良好的传质、传氧效果，借助装置振动使细胞处于分散状态，多用于单细胞及微小细胞团的系统培养。

利用此技术生产细胞源禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)灭活疫苗，选取一株来源清晰的贴壁犬肾细胞(MDCK)以贴壁与悬浮两种方式进行培养，并采用免疫血清学法，针对细胞源、鸡胚源不同来源的病毒制备灭活疫苗并进行评价，结果表明，MDCK细胞悬浮液培养48h，细胞密度约为每毫升3．0×106个，与贴壁细胞培养相比，细胞形态结构清晰，具有较高的细胞活力，且疫苗免疫效果与鸡胚疫苗相近，易实现稳定增殖。

以贴壁与无血清悬浮两种培养方式比较被乙型流感病毒感染的MDCK细胞的增殖情况，在无血清悬浮培养下，流感病毒于MDCK细胞增殖产生的HA血凝滴度更高，为采用生物反应器大规模生产流感疫苗奠定了基础。

悬浮培养技术在猪圆环疫苗生产中的应用表明，细胞悬浮培养相比于贴壁培养技术在疫苗生产中具备更明显的应用优势与更强的免疫原性。

现阶段，以生物反应器为基础的细胞悬浮培养技术平台正逐步建立与完善，合理的设计思路与突破的革新方法，可促使该平台在推动疫苗规模化生产上发挥积极作用。

2.2微载体培养
微载体主要通过为细胞提供贴附接触面积的方式实现细胞的生长繁殖。

微载体因体积小、比重轻等独特优点，在无外界或轻度外力的搅拌和影响下，能完全自由均匀地分布在整个固体培养基内。

该材料生物相容性高、制备简单、可反复多次使用，降低了动物细胞培养的生产成本。

采用生物反应器微载体悬浮培养PK15细胞，以感染复数为0．1的接毒比例微载体培养三代后，所得病毒液效价可达107．25TCID50/mL，为工业化的规模生产提供了有效的数据支撑。

利用微载
体悬浮培养接种猪细小病毒L的猪睾丸传代细胞系(ST细胞)，经二乙烯亚胺(BEI)溶液灭活、浓缩等步骤制备灭活疫苗，接毒72h后收获病毒，滴度为
8．14logTCID50/mL，经灭活后制备疫苗并免疫豚鼠，可获得较高抗体效价。

分
别在5L、50L的生物反应器内微载体悬浮培养Marc145细胞，确定适宜的微载体
浓度为2．5g/L与3．0g/L，该条件下能保证细胞和病毒增殖所需营养且符合经
济要求，提高抗原效价的优势最为显著。

与传统的转瓶式培养方法相比，微载体
技术能够通过大幅提升细胞表面黏附膜的覆盖面积，降低细胞所需的培养容器数量，减少资源和空间成本的消耗，获得较高的病毒滴度与抗体效价。

4我国疫苗生产企业的发展策略
4.1激发疫苗生产企业社会责任意识
在行为模型中，动机是激发行为的首要因素，企业必须承担相应的社会责任，而社会责任的产生需要一定动机激发，比如企业文化。

对于企业来说，文化是企
业得以长远发展的根基，也是企业的灵魂，因此必须树立良好的企业文化与员工
正确的价值观，只有企业文化表现出强烈的社会责任意识，企业内部成员才能更
好地履行社会责任。

此外，有效的内部控制可以改善企业社会责任履行情况，降
低企业经营风险，尤其是股价暴跌风险。

企业内部要有明确的权责分工，定期向
社会公布责任信息，使群众了解企业经营状况。

同时，企业需要自上而下处理内
部社会责任意识淡薄的问题，加大问题事件处罚力度。

4.2提高疫苗企业质量保障能力
疫苗生产企业应加大资金与人才投入，保证疫苗生产质量。

一方面通过加大
研发投入、申请国家项目扶持等避免因投入不足产生缩减成本、降低疫苗质量现象；另一方面通过引进风险投资，建立内部风险评估制度，促进企业长期稳定发展。

此外，疫苗生产企业应建立高素质创新队伍，鼓励技术人员多学习，任何有
成就的团队必定是善于学习的队伍，通过鼓励员工参加企业内外部培训，营造激
励人才发挥机制，有了好的管理机制才能更好地引进人才。

结语
应用生物反应器动物细胞培养技术展开工厂化的病毒疫苗生产，在国外已日
趋成熟，我国疫苗研发市场发展迅速，尽管与发达国家相比仍存在一定程度的差距，但成效显著，生物医药产业水平稳步提升。

伴随着生物反应器设备的优化，
越来越多规模化的动物细胞培养技术开始了更加具备创新涵义与价值取向的变革，为基于细胞培养的病毒疫苗产业化生产提供了新选择，这必将推动我国医用疫苗
领域的长足突破。

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