锯缘青蟹阴离子抗菌肽SCY2基因克隆、表达特性及其抗菌活性的研究

锯缘青蟹阴离子抗菌肽SCY2基因克隆、表达特性及其抗菌活性
的研究
本研究根据实验室获得的SCY2部分cDNA序列,设计特异性引物,以雄性锯缘青蟹的性腺组织RNA为模板,利用RT—PCR及5’,3’-RACE等方法,克隆获得了抗菌肽SCY2的全长cDNA序列947bp,编码100个氨基酸,预测分子量约为10925.4Da,等电点PI为4.84,与已发表的锯缘青蟹抗菌肽Scygonadin基因的氨基酸序列相似性为65.08%,因而认为SCY2是在锯缘青蟹中发现的又一个新的阴离子抗菌肽。

主要结果如下:采用PCR及反向PCR等方法,对基因组DNA及其侧翼序列进行扩增,获得了SCY2基因组DNA的全长序列,该基因组全长为2607bp,包含3个外显子和2个内含子。

与Scygonadin具有相似的基因结构组成;获得了SCY2基因的上下游侧翼序列,5’上游序列含有转录起始位点以及TATA box等启动子所具有的特征序列。

用RT-PCR和Northern-blot等方法,分别检测了SCY2基因在锯缘青蟹(雄性和雌性)不同组织器官(鳃、甲壳、眼、血细胞、肝胰脏、心脏、肌肉、甲壳下皮层、胃和生殖系统等)中的转录表达情况,发现该基因仅在雄性生殖系统中表达。

该表达特性与Scygonadin相似。

检测细菌感染条件下锯缘青蟹各组织SCY2及Scygonadin表达情况,发现在感染后48 h内,SCY2和Scygonadin mRNA在性腺组织中的表达水平均无明显变化,说明外部细菌感染不是SCY2的直接诱导表达因素。

为确定SCY2的抗菌功能,根据SCY2编码序列,构建了pTrc-CKS/SCY2融合基因表达载体。

将表达载体质粒转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,通过变性复性后获得融合蛋白SCY2-CKS。

利用金属鏊合层析纯化获得SCY2融合蛋白,并以3C蛋白酶酶切获得重组表达的SCY2。

用0.4mg/ml重组SCY2在11种海洋动物病原菌和耐药性细菌进行抗菌活性检测(细菌杀伤指数(KI)),结果显示:SCY2能够选择性的抑制革兰氏阴性菌和阳性菌的生长,对水产动物病原菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophia A.h)有显著的抑菌活性,对金黄色葡萄球菌,溶壁微球菌,谷棒杆菌等也具有较强的抑菌作用。