酵母双杂交(自激活)PPT(完整版)

Y e a s t t w o - h y b r i d s y s t e m :
a g e n e t i c a s s a y f o r d e t e c t i n g p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s R e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n i n y e a s t
GAL4BD
自激活原理
Transcription factors
X
X
re p o rte r g e n e
His, β-gal
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
YPDA培养基
YPDA
蛋白胨 酵母提取物 琼脂 0.2%ade 葡萄糖
液体 500ml
10g 5g —— 10ml 10g
固体 100ml
2g 1g 2g 2ml 2g
a g e n e t i c a s s a y f o r d e t e c t i n g p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s
R e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n i n y e a s t
a n d t h e q u e s t io n ,
X
Y
d o t h e s e t w o p r o t e in b in d e a c h o t h e r ?
O n e w a y o fa n s w e r i n g t h i s q u e s t i o n i s t o u s e t h e y e a s tt w o h y b r i d m e t h o d .
X
Y
鲑鱼精 DNA（20μg/μl）沸水中煮20min，冰上冷却10min。
一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列（GAL UAS）结合，但不能引起转录。
3若0不℃到，，20再0r培pm养/m1~in2，hr恒，温若摇还床不振到荡，3换0m单in克X。隆重摇。
Transcription factors
Y e a s t t w o - h y b r i d s y s t e m :
a g e n e t i c a s s a y f o r d e t e c t i n g p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s
S u p p o s e w e h a v e t w o p r o t e i n s . . .
tra n s c rip tio n a c tiv a to r
activatio nd o m ain D N A b in d in g d o m a in
U A S (upstreamactivationsequence)
tra n s c rip tio nm a c h in e ry gene
负对照： pBD-GAL4
取2ml的t Zr 缓a 冲n s 液c /Xri-p gt ailo 溶n 液a 润c 透ti2v 张a 滤to 纸r；
鲑鱼精 DNA（20μa gc /tμiv l）at沸io n 水d 中o m 煮a 2in 0min，冰上冷却10min。
D o th e s e
42℃水浴热休克15min，后冰浴10min。 4000rpm 5minD 于N A 常b 温in 收d i集n g 菌d 体o m ，a i重n 复一次。 常温下，3000rpm离心10s；
tra n s c rip tio nm a c h in e ry
p ro te in s b in d ?
单独的BD和AD都不能激活UAS的下游U A 基S因，它们之间只有通过某种方式结g合e n在e 一起才具有完整的转录激活功能。
（只能现做现用，不能(贮up 存st，re室am 温a 只cti能va 放tio 置n1s-e 2q hu r）en。ce)
GAL4分子的BD可以同上游激活序列 (upstream activating sequence,UAS)结合。
AD则能激活UAS下游的基因进行转录。
单独的BD和AD都不能激活UAS的下游 基因，它们之间只有通过某种方式结合 在一起才具有完整的转录激活功能。
Y e a s t t w o - h y b r i d s y s t e m :
酵母双杂交(自激活)
一、原理
真核生物的转录因子是由两个可以分开的、 功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个 由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个 氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
0.2g ade定容至 100ml → 0.2%的ade母液
theproteinsbind! d o w e g e t e x p r e s s i o n o f t h e r e p o r t e r ?
re p o rte r g e n e
His, β-gal
一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列（GAL UAS）结合，但不能 引起转录。然而，将一段具有转录激活活性 的转录因子基因构建到BD载体上，若其表 达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起 下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双 杂中的自激活现象。反过来，可以利用这种 自激活现象来验证某个转录因子是否具有转 录激活活性。
2g ade定容至 100ml → 0.
X
our two hybrid Y proteinsbind!
弃上清（去干净），用0.
Y
yes,wehaveexpressionof
thereporterindicatingthat
thusformingafunctional transcriptionactivator... X Y