建立液相色谱方法一般步骤
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• 过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞 色谱柱，尤其是使用无机盐配制 的缓冲液。
液相色谱仪的使用
必须做!
溶剂和水的前处理：过滤
• 设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、0.45mm或更 细的水性滤膜和有机滤膜
• 过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵 抽滤
• 过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞 色谱柱，尤其是使用无机盐配制 的缓冲液。
方法
反相 HPLC
离子对 HPLC
正相 HPLC
样品特点/色谱柱
何时应用该方法
流动相：水/有机溶剂
色谱柱：C18（ODS），C8，苯基， 三甲基硅烷，氰基
首选为能溶于水/有机混合物的中性或非 离子化合物。
流动相：水/有机溶剂（一种缓冲 物控制pＨ和离子对试剂）
色谱柱：C18（ODS），C8，氰基
离子或可电离化合物，尤其是碱性或阳 离子化合物的良好选择
液相色谱分析
液相色谱的检测模式
灵敏度、选择性、适应能力
项目 示差折光 电导
响应 灵敏度 线性范围
通用 毫克 104
选择性 纳克 106
流速敏感 温度敏感 梯度淋洗
是 是 不可
是 是 有限制
紫外 选择性
纳克 105 否 否 可以
荧光 选择性
皮克 105 否 否 可以
电化学 选择性
皮克 106 是 是 脉冲可以
改变容量因子 K'
①
①
②
50/50
② ③
③ 60/40
① 40/60
② ③
液相色谱分析
分析方法建立的实例
改变选择性∶a
• 通过改变流动相改变选择性
– 同样强度的不同溶剂
1 THF/H2O 2 28:72
2 MeOH/H2O
3 58:42
1
2
3
3 CH3CN/H2O
4 38:62
• 改变色谱柱
液相色谱分析
如，在反相色谱中，水是弱溶剂。在甲醇/水为流动相的系统中增 加甲醇的比例，流动相变强。
液相色谱的溶剂由弱到强排列的顺序为：正己烷、氯仿、二氯 甲烷、甲基叔丁醚、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈、丙醇、甲 醇。
在反相色谱中有机溶剂增加10％左右，tR和K’值要减少2-3倍。
液相色谱分析
峰位的重排
在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比） 而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的tR，不会发生峰 位重排。在反相色谱中，下列条件改变可能发生峰位重排： （1）流动相中换了强溶剂种类； （2）pH值的改变； （3）柱填料的改变； （4）柱温的改变； （5）流动相组成的改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）
使用柱温箱
柱温控制的优点： • 分析结果重现性好 • 提高柱效 • 降低柱压 • 保证检测稳定性
液相色谱仪的使用
高压输液泵
必须做!
使用输液泵的注意事项
1.每次使用后要把泵中的含盐缓冲液洗干净，防止 盐的沉积，泵要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂 中。
分析方法建立的实例
梯度方法开发实例 - 第一步
• 开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱， 在最初的条件下(0-100% 水-乙腈)，分离不理想。整个 色谱峰组保留时间太长，分离度也不好
液相色谱分析
分析方法建立的实例
梯度方法开发实例 - 第二步
为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例 （50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但 是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存 在，很可能是流动相水中的。
液相色谱分析
液相色谱压力计算
P 25 L0 F /dc 2d e p 2 12 L0F /d 0 p 2e（0.46内径柱）
式中 L――柱长
e――流动相粘度
F――流速，mL/min dc――柱内径，cm
dp――柱填料直径，um
下表红线框内的数字即为该溶液 与水混合后的粘度（在25℃时）
即e
反相色谱常用流动相的粘度值（mPa·s）（25℃）
0.65
正戊烷
0.00
氯仿
0.40
吡啶
0.71
石油醚
0.01
甲乙酮
0.51
正丙醇
0.82
环己烷
0.04
丙酮
0.56
乙醇
0.88
四氯化碳 0.18
二乙胺
0.63
甲醇
0.95
液相色谱仪的使用
必须做!
溶剂和水的前处理：过滤
• 设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、0.45mm或更 细的水性滤膜和有机滤膜
• 过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵 抽滤
液相色谱仪的使用
对流动相的要求
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力， 并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影 响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选 择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意 选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫 外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此 辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严 重干扰组分的吸收测量。
原理：六通阀 注入方式：
1）全量注入 2）部分注入
½Ó Êä Òº ± Ã
手动进样器原理图
½Ó Êä Òº ± Ã
1
2
¶à Óà Ñù Æ·Å · Å 6
× ¢ Éä ¿Ú
3
5
4
½Ó É« Æ×Öù
1
2
6
3
5
4
½Ó É« Æ×Öù
样品装填状态 (LOAD)
注射状态 (INJECT)
液相色谱仪的使用
液相色谱分析
分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 - 第三步
从空白梯度图显示，在同 样的色谱条件，同样的检测灵 敏度下，共有两个杂质峰。说 明流动相水中的杂质在此条件 下可能会对检测有影响。
液相色谱分析
分析方法建立的实例
梯度方法开发实例 - 第四步
空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰） 中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。
液相色谱仪的使用
必须做!
溶剂和水的前处理：脱气
• 设备和材料：超声波清洗机 • 脱气的目的：除去流动相中溶解或因混合而产生
的气泡 • 气泡对测定的影响：
1）柱流量不准 2）检测器基线波动 • 脱气注意点： 1）每天脱气(无在线脱气器时） 2）混合溶剂脱气时间不能过长
液相色谱仪的使用
进样器
• 自动进样器 • 手动进样器
液相色谱分析
分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 - 第五步
根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5 曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。
液相色谱分析
分析方法建立的实例
梯度方法开发实例 - 第六步
根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律， 试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。
液相色谱分析
分析方法建立的实例
梯度方法开发实例 - 第七步
最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。
液相色谱仪的使用
流动相及储液器
1.尽量使用HPLC级的溶剂与试剂. 2.最好使用专用的溶剂瓶来放置流动相 3.改变流动相时防止交叉污染. 4.不要使用陈旧的流动相. 5.定期更换流动相储液瓶. 6.定期清洗烧结不锈钢吸滤头. 7.定期清洗烧结不锈钢吸滤头.
流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由 强渐弱
流速：2ml/min
样品：
① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)
液相色谱分析
分析方法建立的实例
色谱法
色谱柱：类似于反相填料，但疏水 用于分离蛋白质 性小得多
液相色谱分析
液相色谱的保留
保留时间tR的初步估计：
保留时间tR ＝死时间t0(1+峰容量因子k’） 峰的容量因子k’＝（保留时间tR－死时间t0）/死时间t0
t0≈0.5Ld2 tR= t0(1+ k’) k’=(tR-t0)/ t0
左式中：
法）；分离蛋白质、核酸样品及有关化
色谱法 色谱柱：阳离子或阴离子交换
合物的良好选择
体积排阻 色谱法
流动相：水相（GFC）或有机相 （GPC）
色谱柱：GFC用二醇基，GPC用聚苯 乙烯或硅胶，孔径大小支配分子量 范围
分离大分子样品，如蛋白质和人造聚合 物的良好首选，也可用于测量分子量的 分布
疏水作用 流动相：盐溶液
流动相：有机溶剂混合液
色谱柱：氰基，二醇基，氨基，硅 胶
当反相或离子对HPLC无效时的第二个较 好选择；首选为不溶于水/有机混合液的 亲脂样品，异构体混合物和制备HPLC
硅胶最好
液相色谱分析
选择液相色谱的方法
次要液相色谱方法特性
方法
描述/色谱柱
何时应用该方法
离子交换 流动相：水相，另以缓冲物控制pH 分离无机离子混合物的首选（离子色谱
液相色谱仪的使用
常用流动相的紫外截止波长
二四
二四
正
溶
硫氯
氯氯氢丙乙甲
己
苯
水
剂
化化
仿甲呋酮腈醇
烷
碳碳
烷喃
紫外
截止 波长 190 380 265 210 245 233 212 330 190 205 187
nm
液相色谱仪的使用
常用流动相的强度参数
溶剂
ε0
溶剂
ε0
溶剂
ε0
氟烷
－0.25
苯
0.32
乙腈
液相色谱分析
液相色谱分析方法的建立1
建立液相色谱分析方法通常有以下几步：
（1）分子量－在样品预处理或GPC分析时有用 （2）选择合适的液相色谱方法（正相、反相或其他）； （3）选择合适的色谱柱； （4）溶解度－选择流动相的条件 （5）官能团－有否离子化基团？保留特性如何？ （6）样品的基质－考虑是否要前处理，如何前处理
液相色谱分析
液相色谱分析方法的建立2
续前一页
（7）选择合适的K’值的条件； （8）选择良好的峰位（a值）； （9）选择良好的色谱柱条件（N值）；
（10）检测特性－是否有紫外吸收？荧光？ （11）用实测样品解决出现的特殊问题； （12）证实方法的正确性。
液相色谱分析
选择液相色谱的方法
主要液相色谱方法特性
液相色谱仪的使用
对流动相的要求
（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度 也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕 量杂质的存在，将使截止波长值增加50—1OOnm。 （4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。 （5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分 离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于 低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或 检测器内形成气泡，影响分离.
有机溶剂/水（体积比）
甲醇
乙腈
四氢呋喃
0/100 20/80 40/60 60/40 80/20 100/0
0.89
0.89
0.89
1.4
0.98
1.22
1.62
0.89
1.38
1.54
0.72
1.21
1.12
0.52
0.85
0.56
0.35
0.46
液相色谱分析
实验室常备的流动相和固定相
为满足液相色谱的方法选择，实验室应该常备以下的流动相 和固定相 （1）流动相：甲醇、乙腈、纯水、四氢呋喃、正己烷、二氯甲 烷，
t0－进样峰的出峰时间 tR－峰的保留时间 L－柱长(cm) d－柱内径(cm) k’－峰的容量因子
液相色谱分析
反相色谱不同配比流动相与容量因子值
甲醇/水
0/100 10/90 20/80 30/70 40/60 50/50 60/40 70/30 80/20 90/10 100/0
乙腈/水
0/100 6/94 12/88 22/78 32/68 40/60 50/50 60/40 73/27 86/14 100/0
这些溶剂基本上能满足90％以上的液相色谱分离问题。 （2）固定相：C18键合相柱、硅胶柱、氰基柱、氨基柱。
几点注意事项
色谱柱和流动相确定以后，为想获得满意的色谱分离，可进 一步选择柱长、填料粒度和流速等。需要指出的是某些样品在进 样前要进行很完全的样品预处理，另外，许多样品则需要梯度洗 脱，当色谱条件有所改变时，需要寻找更合适的分离条件。
液相色谱分析
开发液相色谱分析方法
分辨率是色谱分析中主要考虑的因素。
在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率 之外，以下因素都要考虑。
1.灵敏度 2.载样量 3.分析速度 4.溶剂消耗
5.成本 6.容易使用 7.色谱柱寿命 8.效率
液相色谱分析
分析方法建立的实例
等度分析 色谱柱：C18，4mm×30mm
四氢呋喃/水
0/100 4/96 10/90 17/83 23/77 30/70 37/63 45/55 53/47 63/37 72/28
峰容量因子值
100 40 16 6 2.5 1 0.4 0.2 0.06 0.03 0.01
液相色谱分析
溶剂强度
改变流动相的组成或溶剂的强度，就可以改变K’和tR。在一定 的条件下，减少保留时间或缩短分析时间的溶剂（小tR和K’值）为 强溶剂，增加或延长分析时间的溶剂（大tR和K’值）为弱溶剂。例
液相色谱仪的使用
必须做!
溶剂和水的前处理：过滤
• 设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、0.45mm或更 细的水性滤膜和有机滤膜
• 过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵 抽滤
• 过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞 色谱柱，尤其是使用无机盐配制 的缓冲液。
方法
反相 HPLC
离子对 HPLC
正相 HPLC
样品特点/色谱柱
何时应用该方法
流动相：水/有机溶剂
色谱柱：C18（ODS），C8，苯基， 三甲基硅烷，氰基
首选为能溶于水/有机混合物的中性或非 离子化合物。
流动相：水/有机溶剂（一种缓冲 物控制pＨ和离子对试剂）
色谱柱：C18（ODS），C8，氰基
离子或可电离化合物，尤其是碱性或阳 离子化合物的良好选择
液相色谱分析
液相色谱的检测模式
灵敏度、选择性、适应能力
项目 示差折光 电导
响应 灵敏度 线性范围
通用 毫克 104
选择性 纳克 106
流速敏感 温度敏感 梯度淋洗
是 是 不可
是 是 有限制
紫外 选择性
纳克 105 否 否 可以
荧光 选择性
皮克 105 否 否 可以
电化学 选择性
皮克 106 是 是 脉冲可以
改变容量因子 K'
①
①
②
50/50
② ③
③ 60/40
① 40/60
② ③
液相色谱分析
分析方法建立的实例
改变选择性∶a
• 通过改变流动相改变选择性
– 同样强度的不同溶剂
1 THF/H2O 2 28:72
2 MeOH/H2O
3 58:42
1
2
3
3 CH3CN/H2O
4 38:62
• 改变色谱柱
液相色谱分析
如，在反相色谱中，水是弱溶剂。在甲醇/水为流动相的系统中增 加甲醇的比例，流动相变强。
液相色谱的溶剂由弱到强排列的顺序为：正己烷、氯仿、二氯 甲烷、甲基叔丁醚、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈、丙醇、甲 醇。
在反相色谱中有机溶剂增加10％左右，tR和K’值要减少2-3倍。
液相色谱分析
峰位的重排
在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比） 而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的tR，不会发生峰 位重排。在反相色谱中，下列条件改变可能发生峰位重排： （1）流动相中换了强溶剂种类； （2）pH值的改变； （3）柱填料的改变； （4）柱温的改变； （5）流动相组成的改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）
使用柱温箱
柱温控制的优点： • 分析结果重现性好 • 提高柱效 • 降低柱压 • 保证检测稳定性
液相色谱仪的使用
高压输液泵
必须做!
使用输液泵的注意事项
1.每次使用后要把泵中的含盐缓冲液洗干净，防止 盐的沉积，泵要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂 中。
分析方法建立的实例
梯度方法开发实例 - 第一步
• 开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱， 在最初的条件下(0-100% 水-乙腈)，分离不理想。整个 色谱峰组保留时间太长，分离度也不好
液相色谱分析
分析方法建立的实例
梯度方法开发实例 - 第二步
为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例 （50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但 是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存 在，很可能是流动相水中的。
液相色谱分析
液相色谱压力计算
P 25 L0 F /dc 2d e p 2 12 L0F /d 0 p 2e（0.46内径柱）
式中 L――柱长
e――流动相粘度
F――流速，mL/min dc――柱内径，cm
dp――柱填料直径，um
下表红线框内的数字即为该溶液 与水混合后的粘度（在25℃时）
即e
反相色谱常用流动相的粘度值（mPa·s）（25℃）
0.65
正戊烷
0.00
氯仿
0.40
吡啶
0.71
石油醚
0.01
甲乙酮
0.51
正丙醇
0.82
环己烷
0.04
丙酮
0.56
乙醇
0.88
四氯化碳 0.18
二乙胺
0.63
甲醇
0.95
液相色谱仪的使用
必须做!
溶剂和水的前处理：过滤
• 设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、0.45mm或更 细的水性滤膜和有机滤膜
• 过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵 抽滤
液相色谱仪的使用
对流动相的要求
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力， 并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影 响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选 择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意 选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫 外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此 辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严 重干扰组分的吸收测量。
原理：六通阀 注入方式：
1）全量注入 2）部分注入
½Ó Êä Òº ± Ã
手动进样器原理图
½Ó Êä Òº ± Ã
1
2
¶à Óà Ñù Æ·Å · Å 6
× ¢ Éä ¿Ú
3
5
4
½Ó É« Æ×Öù
1
2
6
3
5
4
½Ó É« Æ×Öù
样品装填状态 (LOAD)
注射状态 (INJECT)
液相色谱仪的使用
液相色谱分析
分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 - 第三步
从空白梯度图显示，在同 样的色谱条件，同样的检测灵 敏度下，共有两个杂质峰。说 明流动相水中的杂质在此条件 下可能会对检测有影响。
液相色谱分析
分析方法建立的实例
梯度方法开发实例 - 第四步
空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰） 中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。
液相色谱仪的使用
必须做!
溶剂和水的前处理：脱气
• 设备和材料：超声波清洗机 • 脱气的目的：除去流动相中溶解或因混合而产生
的气泡 • 气泡对测定的影响：
1）柱流量不准 2）检测器基线波动 • 脱气注意点： 1）每天脱气(无在线脱气器时） 2）混合溶剂脱气时间不能过长
液相色谱仪的使用
进样器
• 自动进样器 • 手动进样器
液相色谱分析
分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 - 第五步
根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5 曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。
液相色谱分析
分析方法建立的实例
梯度方法开发实例 - 第六步
根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律， 试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。
液相色谱分析
分析方法建立的实例
梯度方法开发实例 - 第七步
最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。
液相色谱仪的使用
流动相及储液器
1.尽量使用HPLC级的溶剂与试剂. 2.最好使用专用的溶剂瓶来放置流动相 3.改变流动相时防止交叉污染. 4.不要使用陈旧的流动相. 5.定期更换流动相储液瓶. 6.定期清洗烧结不锈钢吸滤头. 7.定期清洗烧结不锈钢吸滤头.
流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由 强渐弱
流速：2ml/min
样品：
① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)
液相色谱分析
分析方法建立的实例
色谱法
色谱柱：类似于反相填料，但疏水 用于分离蛋白质 性小得多
液相色谱分析
液相色谱的保留
保留时间tR的初步估计：
保留时间tR ＝死时间t0(1+峰容量因子k’） 峰的容量因子k’＝（保留时间tR－死时间t0）/死时间t0
t0≈0.5Ld2 tR= t0(1+ k’) k’=(tR-t0)/ t0
左式中：
法）；分离蛋白质、核酸样品及有关化
色谱法 色谱柱：阳离子或阴离子交换
合物的良好选择
体积排阻 色谱法
流动相：水相（GFC）或有机相 （GPC）
色谱柱：GFC用二醇基，GPC用聚苯 乙烯或硅胶，孔径大小支配分子量 范围
分离大分子样品，如蛋白质和人造聚合 物的良好首选，也可用于测量分子量的 分布
疏水作用 流动相：盐溶液
流动相：有机溶剂混合液
色谱柱：氰基，二醇基，氨基，硅 胶
当反相或离子对HPLC无效时的第二个较 好选择；首选为不溶于水/有机混合液的 亲脂样品，异构体混合物和制备HPLC
硅胶最好
液相色谱分析
选择液相色谱的方法
次要液相色谱方法特性
方法
描述/色谱柱
何时应用该方法
离子交换 流动相：水相，另以缓冲物控制pH 分离无机离子混合物的首选（离子色谱
液相色谱仪的使用
常用流动相的紫外截止波长
二四
二四
正
溶
硫氯
氯氯氢丙乙甲
己
苯
水
剂
化化
仿甲呋酮腈醇
烷
碳碳
烷喃
紫外
截止 波长 190 380 265 210 245 233 212 330 190 205 187
nm
液相色谱仪的使用
常用流动相的强度参数
溶剂
ε0
溶剂
ε0
溶剂
ε0
氟烷
－0.25
苯
0.32
乙腈
液相色谱分析
液相色谱分析方法的建立1
建立液相色谱分析方法通常有以下几步：
（1）分子量－在样品预处理或GPC分析时有用 （2）选择合适的液相色谱方法（正相、反相或其他）； （3）选择合适的色谱柱； （4）溶解度－选择流动相的条件 （5）官能团－有否离子化基团？保留特性如何？ （6）样品的基质－考虑是否要前处理，如何前处理
液相色谱分析
液相色谱分析方法的建立2
续前一页
（7）选择合适的K’值的条件； （8）选择良好的峰位（a值）； （9）选择良好的色谱柱条件（N值）；
（10）检测特性－是否有紫外吸收？荧光？ （11）用实测样品解决出现的特殊问题； （12）证实方法的正确性。
液相色谱分析
选择液相色谱的方法
主要液相色谱方法特性
液相色谱仪的使用
对流动相的要求
（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度 也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕 量杂质的存在，将使截止波长值增加50—1OOnm。 （4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。 （5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分 离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于 低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或 检测器内形成气泡，影响分离.
有机溶剂/水（体积比）
甲醇
乙腈
四氢呋喃
0/100 20/80 40/60 60/40 80/20 100/0
0.89
0.89
0.89
1.4
0.98
1.22
1.62
0.89
1.38
1.54
0.72
1.21
1.12
0.52
0.85
0.56
0.35
0.46
液相色谱分析
实验室常备的流动相和固定相
为满足液相色谱的方法选择，实验室应该常备以下的流动相 和固定相 （1）流动相：甲醇、乙腈、纯水、四氢呋喃、正己烷、二氯甲 烷，
t0－进样峰的出峰时间 tR－峰的保留时间 L－柱长(cm) d－柱内径(cm) k’－峰的容量因子
液相色谱分析
反相色谱不同配比流动相与容量因子值
甲醇/水
0/100 10/90 20/80 30/70 40/60 50/50 60/40 70/30 80/20 90/10 100/0
乙腈/水
0/100 6/94 12/88 22/78 32/68 40/60 50/50 60/40 73/27 86/14 100/0
这些溶剂基本上能满足90％以上的液相色谱分离问题。 （2）固定相：C18键合相柱、硅胶柱、氰基柱、氨基柱。
几点注意事项
色谱柱和流动相确定以后，为想获得满意的色谱分离，可进 一步选择柱长、填料粒度和流速等。需要指出的是某些样品在进 样前要进行很完全的样品预处理，另外，许多样品则需要梯度洗 脱，当色谱条件有所改变时，需要寻找更合适的分离条件。
液相色谱分析
开发液相色谱分析方法
分辨率是色谱分析中主要考虑的因素。
在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率 之外，以下因素都要考虑。
1.灵敏度 2.载样量 3.分析速度 4.溶剂消耗
5.成本 6.容易使用 7.色谱柱寿命 8.效率
液相色谱分析
分析方法建立的实例
等度分析 色谱柱：C18，4mm×30mm
四氢呋喃/水
0/100 4/96 10/90 17/83 23/77 30/70 37/63 45/55 53/47 63/37 72/28
峰容量因子值
100 40 16 6 2.5 1 0.4 0.2 0.06 0.03 0.01
液相色谱分析
溶剂强度
改变流动相的组成或溶剂的强度，就可以改变K’和tR。在一定 的条件下，减少保留时间或缩短分析时间的溶剂（小tR和K’值）为 强溶剂，增加或延长分析时间的溶剂（大tR和K’值）为弱溶剂。例