环境微生物的检测与分析

环境微生物的检测与分析
实验报告
实验一土壤微生物拮抗菌的分离与测数
一、实验目的
1、熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。

2、初步掌握从土壤中分离微生物和测数的基本方法。

3、了解培养基的配制原理，掌握其配制过程和方法。

4、掌握实验室几种灭菌方法及技术。

5、掌握无菌操作技术。

6、了解平板菌落计数的原理。

7、识别土壤中几大类微生物的菌落特征。

8、学习拮抗作用的试验方法，观察微生物间的拮抗现象及抗生素的抗菌作用。

二、实验材料
1、器材：电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、1mL的无菌吸管、10mL的刻度试管、无菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH试纸、封口膜、记号笔、线绳、纱布、培养皿、高压蒸汽灭菌器、称量纸、药匙、试管架、涂布棒、酒精灯、超净工作台、火柴。

2、试剂和材料：无菌牛皮纸袋、无菌铲、标签、打孔器，镊子，牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO
3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、蒸馏水、新鲜马铃薯、10%酚酞、乳酸。

三、实验步骤
（一）培养基的配制
（1）配制牛肉膏蛋白胨（NA）培养基
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。

配方如下：牛肉膏 3 g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 15-20g 水 1000 mL pH 7.4-7.6
1、称量药品
按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入搪瓷缸中。

牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入搪瓷缸。

蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

2、加热溶解
在搪瓷缸中加入少量少于所需的水量，然后放入锅中，在电磁炉上小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。

若配制固体培养基，则需先调pH值后再溶解琼脂，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。

3、调pH
用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。

若偏碱，则用1 mol/l HCL进行调节。

pH调节通常放在加琼脂之前。

注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。

4、过滤
液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。

5、分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。

分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。

分装量：固体培养基约至试管高度的 1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。

6、加棉塞
试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。

棉塞的形状、大小和松紧度要适合，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。

要使棉塞总长3/5塞入试管口或瓶口内，以防止棉花脱落。

有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。

有时也可用试管帽、塑料塞或封口膜代替棉塞。

7、包扎
加塞后，将三角瓶的棉花外包一层牛皮纸或双层报纸，以防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞。

若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉花塞外包一层牛皮纸。

然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

8、灭菌
将上述培养基于121摄氏度湿热灭菌30 min。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

9、摆斜面
灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的
长度不超过试管总长的1/2；待其凝固，
10、无菌检查
将灭菌的培养基放入37摄氏度温箱中培养24~48h，无菌生长即可使用。

或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。

（2）、配制高氏一号培养基
高氏一号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。

配方如下：可溶性淀粉20g KNO3 1 g NaCl 0.5 g K2HPO4 0.5 g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01 g 琼脂20g 蒸馏水1000mL pH7.4~7.6
1、称量和溶解
先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入搪瓷缸中，并用少量冷水将其调成糊状，再加少许少量少于所需的水量，放入锅中在电磁炉上边加热边搅拌，至其完全溶解。

对微量成分FeSO4·7H2O可先配制成高浓度的储备液后再加入，方法是先在100 ml 水中加入
1g的FeSO4·7H2O，配成0.01 mg/ml的储备液，再在1000 ml的培养基中加入以上储备液0.1 ml即可。

待所有的药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

如果要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

2、pH 调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同上。

（3）配制马铃薯蔗糖培养基
马铃薯蔗糖培养基是用于分离真菌的选择培养基。

配方如下：去皮的马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂20g 蒸馏水1000mL，自然pH
1、称量和溶解
先计算后称量，按用量称取各成分。

将去皮的马铃薯切片后放入锅中，然后加少许少
于所需的水量在电磁炉上加热20 min，然后用双层砂布过滤，滤液重新放入锅中煮沸，然
后加入称量好的蔗糖和琼脂，待各成分溶解后，补充水分至所需体积。

2、同（2）2
（二）制备土壤稀释液
（1）取土壤
取表层以下 5~10 cm 处的土壤样品，放入灭菌的牛皮纸袋中，用铅笔填写好标签，袋内外各具一张。

（2）土壤预处理及保存
将采集的样品带回实验室平摊在聚乙烯塑料布上，在室温下阴干，土块捏碎，并检出植物根、茎、叶及石块等杂物，约20号筛筛分。

土壤处理好后备用，或放在4摄氏度冰箱暂存。

（3）制备土壤稀释液（要无菌操作）
1、制备土壤悬液
取土样 5 g，迅速倒入带玻璃珠的45 mL无菌三角瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底为最好），置摇床中振荡 5~10 min，使土样充分打散，即成 10-1的土壤悬液。

2、稀释
用无菌移液管吸10-1的土壤悬液0.5 mL，放入4.5 mL 无菌水中，震荡混匀即为10-2稀释液，如此重复，可依次制成10-2 ~10-9的稀释液。

注意：操作时移液管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支移液管，每次吸土液，要将移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。

实验三变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析技术及其在微生物
种群多样性研究中的应用
一、实验目的
1、了解并掌握变性梯度凝胶电泳的原理。

2、掌握变性梯度凝胶电泳分析植物内生菌种群多样性。

二、实验材料
1、实验材料
生长健壮的植株。

2、实验仪器
PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、变性梯度凝胶电泳仪（仪器型号：Decode Universal Mutation Detection System）、凝胶成像及分析系统、高速离心机。

3、实验试剂
（1）CTAB-NaCl
4.1 g NaCl称溶解在80 mL水中，再缓慢加入10 g 的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热65℃溶解搅拌，定容至1000 mL。

（2）50×TAE 缓冲液
121 g Tris，18.6 g EDTA，量取28.6 mL冰醋酸，加水至500 mL，pH 8.5。

（3）10% APS（过硫酸铵贮存液）
10 mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL 。

（4）TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)
10% APS：TEMED = 4.5：1
（5）变性剂贮存液(0%)：6%丙烯酰胺
100 mL 溶液：15 mL 40% Arc/Bis，2 mL50×TAE 缓冲液，加水至100 mL。

（6）变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺
15 mL 40% Arc/Bis；2 mL 50×TAE 缓冲液；40 mL去离子甲酰胺；42 g尿素，加水
至100 mL。

（7）溴化乙锭EB溶液
50mg溴化乙锭溶于100ml双蒸水，工作浓度为0.5μg/ml，避光保存。

（8）固定液1
50 mL无水乙醇加入去离子水至500 mL。

（9）固定液2
5 mL硝酸加入去离子水至500 mL。

（10）0.12%银染试剂
0.18g AgNO3加入去离子水至150 mL，同时加入110 μL 37%-40%的甲醛混匀即可，需新鲜配制。

（11）显色液
4.5g Na2CO3加入去离子水至150 mL，需新鲜配制，4℃冰箱保存备用，用前加入75 μL甲醛构成显影液。

（12）终止液
15 mL冰乙酸加入去离子水至500 mL。

4、PCR扩增引物
第一轮PCR引物：fM1: 5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’和rC5: 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’
f515-GC:5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGGTGCCAGCM GCCGCGGTAA-3’和rC5: 5’-TAA TCCTGTTTGCTCCCCAC-3’
三、实验步骤
（一）基因组提取及PCR扩增
1、总基因组的提取
采用改良的CTAB法提取植物样品的总基因组DNA，方法如下：
（1）将预处理后的2 g样品在无菌研钵内用液氮充分研磨至细粉末状，称取0.2 g样品装入1.5 ml 无菌的eppendorf管中。

（2）加入1 mL CTAB提取液（65℃预热），立即混匀，65℃水浴90 min，每间隔20-30 min轻轻颠倒eppendorf管混匀一次，12000 rpm 4℃离心10 min。

（3）取上清，加2/3体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒数次充分混匀，12000 rpm，4℃，离心10 min，如此重复至上层变澄清。

（4）取上清，加2/3体积的氯仿/异戊醇（24：1），颠倒数次充分混匀，12000 rpm，4℃离心10 min。

（5）取上清，加1/10体积的NaAC溶液和1个体积的无水乙醇（-20℃预冷），在-20℃下沉淀30 min以上，8000 rpm离心5 min。

（6）弃上清，用70%酒精洗涤沉淀2次，8000 rpm离心5 min，真空干燥15 min。

（7）加50 μL TE溶液或ddH2O溶解DNA，取5 μL 上样，1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存。

2、16srDNA基因序列的PCR扩增
巢式PCR（Nested PCR）是使用两对PCR引物扩增目的DNA片段，第二对引物称为巢式引物，扩增的目的片段包含在第一次PCR扩增片段的内部，保证第二次PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增。

因为第二对引物要用于DGGE电泳分析，根据DGGE电泳的原理，上游引物的5’端加上一段40 bp 左右的GC碱基序列（5’-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG-3’）。

巢式PCR第一次PCR以总基因组为模板，扩增出内生菌的目的基因片段，第二次PCR 以第一次PCR产物为模板，并且退火温度较高。

反应体系如下：
反应条件为：
94℃4min
94℃1min
50℃1min 30cycles
72℃1min
72℃8min
8℃∞
（三）DGGE电泳
采用Decode Universal Mutation Detection System（Bio-Rad，USA）对PCR扩增产物进行电泳分离。

具体步骤如下：
1、胶槽的组装
先用95%乙醇清洗两块玻璃板及两个间隔条，再用蒸馏水清洗一遍，干燥。

将间隔条置于大玻璃板两侧边缘并且缺口处放在内侧，再将小玻璃板放在上面并与之对齐，用夹子将两块玻璃板固定，并调水平及垂直平衡。

2、DGGE胶的制做
采用6%丙烯酰胺凝胶，根据不同目的片段的大小将0%和100%的变性剂按照相应的比例配置不同的高浓度和低浓度的变性缓冲液，分别取高浓度和低浓度的变性剂溶液20 mL，加90 μL的 4.5 μL/mL 10% APS和20 μL的lμL/mL的TEMED（APS：TEMED =4.5:1），立即颠倒混合均匀。

将高浓度变性剂溶液和低浓度变性剂溶液分别吸入相应的针筒，并固定在梯度形成器对应的高低浓度两侧，将出胶针头置于胶板之间。

推动梯度形成器，将胶灌入两个玻璃板之间，注意避免产生气泡。

灌胶结束后，在胶板顶部小心倾斜插入梳子(避免产生气泡)，静置1.5-2 hr待胶凝固。

及时将针筒中剩余的溶液排净并清洗干净。

3、电泳
在DGGE电泳槽中加入7L新鲜配置的1×TAE缓冲液，使电泳槽中的缓冲液页面至“Full”和“Run”中间的位置，将胶板固定在黄色的凝胶板架上，放进电泳槽中，最后将温度控制器盖在电泳槽上。

接通电源，打开电泳仪预热使缓冲液的温度达到60℃。

轻轻将梳子拔出，将加样孔中的缓冲液用加样针吸出，缓缓加入约30 μL 第二次PCR产物与6×Loading Buffer的混合液，100V电压电泳12 hr。

4、染色
DNA染色采用银染试剂盒进行银染，具体过程包括以下步骤：
a) 固定1：将凝胶加入固定液1，轻轻摇动孵育10 min，小心弃掉液体；
b) 固定2：加入固定液2，轻轻摇动孵育3 min，小心弃掉液体；
c）用去离子水漂洗三次，每次5 min；
d）银染：加入0.12%银染试剂暗处孵育20 min，弃液；
e）去离子水冲洗两次，每次2 min，充分倒掉去离子水；
f）显色：加入显色液，轻轻摇动孵育5-20 min，进行显色；
g）终止反应：当显色步骤中凝胶条带清晰时，立即倒掉显色液，加入入终止液。

5、拍照快速银染后，进行DGGE凝胶图片的拍照。

四、实验结果分析与讨论
在提取质粒的环节，我们小组最终提取出来的质粒由于含量较少，所以最终肉眼看不到。

我们在做PCR之前稀释的倍数较少，以尽量减少DNA浓度的过度降低。

我们在提取质粒的时候，由于没有带口罩以及消毒的措施，很容易造成所提取的质粒降解，使DNA浓度下降。

上图为聚丙烯酰胺凝胶电泳的跑胶图片，从荧光带整体上看，实验结果还不错，由于每个小组提取的DNA的浓度不同，所以PCR和DGGE电泳之后额条带效果会存在差异。