纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响

纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第3页
➢ 影响骨植入界面主要相关参数有表面成份，表面 能，表面粗糙度和表面形貌。
➢ 研究者已经证实将材料表面控制在微米或纳米范 围内能够改变各种类型细胞分化程度。骨有一系 列分等级结构包含宏观结构，微观结构和纳米结 构。所以，材料表面有等级形貌，类似于骨分级 结构，将诱导不一样生物反应。本文叙述纳米级 形貌对成骨细胞功效影响。经过检测得知碱性磷 酸酶（ALP）活性和基质产量增多。
➢ 细胞培养一周后，与无定形态氧化铝相比，纳米 多孔氧化铝表面有更高细胞粘附，增殖和生存能 力。
➢ 细胞培养三周后，在纳米多孔氧化铝表面细胞有 更高碱性磷酸酶活性，钙和磷浓度也更高。
➢ 所以，这项研究证实使用可控制纳米结构材料能 够大大地改进骨细胞性能，纳米材料在整形外科 移植含有很大潜力。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
图五为 MTT分析在纳米多孔和无定形态氧化铝表面细胞（培养1天和4天时） 中甲瓒吸光度 。结果显示细胞在纳米多孔氧化铝（ n=3，p<0.01）表面活细胞 数更多，即含有更高生存能力。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第19页
细胞功效
图六为在材料表面被Calcein-AM着色活细胞图 (10×)。
纳米多孔Al2O3薄膜制备
99.99%铝片
（2cm×2cm×0.5mm ）
第一步阳极氧化
马弗炉，500℃，4h
高温退火
除油
磷酸和硫酸混合液 （体积比为3:2）
丙酮， 3min， 室温
电化学抛光
草酸， 冰浴，
清洗 4%铬酸和8%磷酸混合液
60℃，30min
第二步阳极氧化
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
对硝基苯磷酸二钠+H2O 碱性磷酸酶 对硝基苯酚+H3PO4
在室温下，用混有2%多聚甲醛 热PBS溶液冲洗细胞三次
细胞固定好之后，向25mL去离子水中 加入25mL碱性缓冲溶液制成碱性磷酸 酶作用物溶液充分冲洗
移去0.5mL溶液同时加入0.5mL NaOH终止反应
每个细胞培养板孔内加入1mL碱性磷 酸酶作用物溶液在37℃条件下反应30 分钟
细胞在无定形态氧化铝表面为球形，而在纳米氧化铝表面为展开状态。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第20页
碱性磷酸酶活性
图七为无定形态和纳米多孔氧化铝表面细胞（培养2和3周后）碱性磷酸酶活性测定， 经过测定在410nm处对硝基苯酚吸光度改变速率来计算ALP 活性，结果显示培养在纳 米多孔氧化铝(n=3，p<0.01)表面细胞有更高碱性磷酸酶活性。
将密度为15-25×106/孔骨髓基质细胞和消毒过纳米多孔薄膜一起放在六 孔细胞培养板里
无定形态氧化铝薄膜作为对照试验
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第11页
1 细胞粘附和增殖 2 细胞生存能力 3 细胞功效
碱性磷酸酶（ALP）活性 4
评定 细胞外基质
5
方向
细胞形态
6
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
细胞功效
将粘附在氧化铝 薄膜上细胞用CalceinAM着色检测细胞内 酯酶活性。 CalceinAM乙酸甲基酯亲脂 性很高，使其可透过 细胞膜，在活细胞内 酯酶作用下，脱去 AM基，产生Calcein 能发出强绿色荧光 ， 从而反应酯酶活性。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第13页
碱性磷酸酶（ALP）活性(细胞培养三周后检测)
第7页
磷酸和硫 酸混合液
（80～90℃）
图一 电化学抛光装置（10 ～ 15min）
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第8页
（冰浴）
草酸溶液
(0.2～0.5mol/L)
30 ～50V
图二 铝阳极氧化试验装置 (60 ～300min)
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第9页
图三 纳米多孔氧化铝扫描电镜图（孔径为79nm）
0.21±0.003 0.33±0.003
与无定形态氧化铝相比，在纳米多孔氧化铝
表面，每七天钙和磷百分比都比较高。说明在纳 米多孔氧化铝表面成骨细胞产生更多细胞外基质 （p＜0.01）。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第22页
成骨细胞形态（1周后）
Amorphous
Nanoporous
图八 扫描电镜图像显示细胞在培养1周后粘附情况，与无定形态氧化铝相比， 细胞在纳米多孔氧化铝表面聚集并展现展开形态，说明细胞对纳米结构更适应。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第15页
细胞形态
➢ 在细胞培养三周后，用扫描电镜观察细胞形态。
细胞固定，脱水
用PBS溶液冲洗2次
用含有0.1M甲胂酸钠和 0.1M蔗糖缓冲液冲洗两次， 每次5分钟
在含有3%戊二醛，0.1M甲胂酸钠，0.1M蔗 糖定影剂中浸泡45分钟
依次用35%，50%，70%，95%和 100%乙醇脱水细胞各10分钟
第26页
文件出处
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第1页
目 录
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
介绍 材料和方法 试验结果
结论
第2页
介绍
用于骨科整形生物材料面临一个挑战就是 设计材料表面能够满足以下两个条件：
➢允许依赖锚定成骨细胞粘附； ➢提升成骨细胞分化能力，从而使成熟成骨
细胞群体能够在适当生物材料表面快速地 形成一个界面层。
骨髓基质细胞（ MSCs）
骨髓基质细胞在培养过程中可向成骨细胞方向分化，伴随培养时间 延长，尤其是在一些生长因子影响下，90 %以上细胞可表现出成骨细胞 特征，因为骨髓基质细胞取材方便、成骨能力较明确，同时起源广泛， 所以能够用来评价它们与纳米结构表面相互作用。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第6页
第17页
细胞粘附和增殖
图四为用血细胞计数器测得细胞在纳米多孔氧化铝和无定形态氧化铝表面粘附 （培养1天后）和增殖（培养4天和7天后）能力。 结果显示，与无定形态氧化铝相比，纳米多孔氧化铝表面 (n=3，p<0.01)细胞粘 附和增殖能力更强。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第18页
细胞生存能力
Amorphous
Nanoporous
图十 在培养3周后，纳米多孔氧化铝表面增殖细胞经过储存基质形成网状结 构，而在无定形态氧化铝表面无此网状结构。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第25页
结论
➢ 设计一个与成骨细胞有良好反应材料对于整形外 科生物材料研究十分主要。在本文中，使用经过 两步阳极氧化法制得纳米多孔氧化铝薄膜检测其 在短期内和长久内与细胞反应。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第4页
➢Klawitter 和Hulbert [1] 使用氧化陶瓷，证实了孔径为100µm多孔表 面对于适当骨内生是必须。
➢Bobyn 等 [2]使用金属植入管，当孔径在50-400µm之间表现出良好骨
已
内生性。
做
➢研究显示[3]在高密度氧化金属层上更小孔径能允许骨长入。比如，
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第5页
试验材料
纳米多孔氧化铝 (Al2O3)
作为一个生物可相容陶瓷，已被广泛地应用于整形外科和牙移植手 术。氧化物使铝表面在生物环境中含有惰性，所以它是移植工程应用中 可供选择一个材料。经过阳极氧化处理控制纳米多孔氧化铝结构，并维 持纳米相材料或微米结构陶瓷不含有机械特征。
用六甲基二硅烷浸泡细胞十分钟， 使细胞干燥。然后倒掉六甲基二硅 烷，使材料表面风干30分钟
将材料表面镀上一层10nm金，扫描电镜电压设置为10-20kV
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第16页
细胞形态
细胞粘附和增殖
细胞外基质
结果
细胞生存能力
碱性磷酸酶活性
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
细胞功效
经过测定在410nm处吸光度改变速率来计算ALP活性
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第14页
细胞外基质(细胞培养三周后)
• 钙和磷是骨基质主要成份，一旦细胞在材料表面 开始分化，它们将沉积骨基质。从细胞培养板上 取出样品风干，进行XPS分析检测钙和磷含量。
• XPS（X射线光电子能谱）原理是用X射线去辐射 样品，使原子或分子内层电子或价电子受激发射 出来。被光子激发出来电子称为光电子。能够测 量光电子能量，以光电子动能为横坐标，相对强 度（脉冲/s）为纵坐标可做出光电子能谱图。依 据能谱图中光电子谱线强度（光电子峰面积）反 应原子含量或相对浓度 。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第23页
成骨细胞形态（2周后）
Amorphous
Nanoporous
图九 细胞(培养2周后)在无定形态和纳米多孔氧化铝表面扫描电镜图像。细胞在纳 米多孔氧化铝表面进行延伸，进入分化阶段，而在无定形态氧化铝表面呈球形。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响Biblioteka 第24页成骨细胞形态（3周后）
实
在外科手术2-3周后，Ca–P涂层多孔植入管和人骨展现出了相同骨内 生性。
验
➢在一项研究中，伴随纳米氧化铝颗粒从167nm降到24nm，成骨细胞
粘附增加50%。与常见孔径（微米级）氧化铝相比，细胞增殖能力，
碱性磷酸酶活性，细胞外基质产量都有显著增加。
[1]Klawitter JJ, Hulbert SF. Application of porous ceramics for the attachment of load bearing internal orthopedic applications.J Biomed Mater Symp 1972;2:161–229. [2] Bobyn JD, Pilliar RM, Cameron HU, Weatherly GC. The optimum pore size for the fixation of porous-surfaced metal implants by the ingrowth of bone. Clin Orthop Relat Res 1980;150:263–270. [3] Lee TM, Wang BC, Yang YC, Chang E. Comparison of plasma-sprayed hydroxyapatite coatings and hydroxyapatite/ tricalcium phosphate composite coatings: In vivo study. J Biomed Mater Res ;55:360–367.
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第21页
细胞外基质
表一 XPS分析检测纳米多孔和无定形态氧化铝表面细胞钙和磷浓度
第2周 第3周
Ca/Al
纳米多孔 无定形态
> 0.37±0.002
0.46±0.003
0.13±0.002 0.21±0.001
P/Al
纳米多孔 无定形态
> 0.45±0.001
0.72±0.002
第12页
细胞粘附和增殖
骨髓基质细胞密 度为15×106细胞/孔 。在培养一天后，用 胰蛋白酶处理，使细 胞分离，观察细胞粘 附情况，培养四天和 七天后观察其增殖能 力，用血细胞计数器 计数。
细胞生存能力
用四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色法检测其生 存能力。其检测原理为 活细胞线粒体中琥珀酸 脱氢酶能打开四唑环， 使外源性MTT还原为水 不溶性蓝紫色结晶甲瓒 并沉积在细胞中，而死 细胞无此功效。二甲基 亚砜能溶解细胞中甲瓒 ，用酶联免疫检测仪在 570nm波优点测定其光 吸收值，可间接反应活 细胞数量。
纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响
第10页
细胞培养准备
纳米多孔氧化铝薄膜放在六孔细 胞培养板里加上盖子在紫外光下 预消毒24小时
Jackson试验室C57 BJ 小鼠
薄膜浸在70%乙醇中消毒 30分钟
处死，取下胫骨和股骨
10mL注射器内吸入改良MEM培养液冲 洗骨髓腔内容物
70µm尼龙过滤器
切除两端干骺端，显露骨髓腔 用血细胞计数器计算细胞数量