小麦非生物胁迫相关lea蛋白wzy1-2与wrab18的功能研究

小麦非生物胁迫相关LEA蛋白WZY1-2与WRAB18的功能研究
摘要
在植物的整个生命过程中，常会遭遇干旱、高盐、高温、冷害以及病虫害等逆境胁迫，影响其正常生长。

逆境可造成植物细胞不同程度的损伤，严重时将直接导致植株的死亡。

逆境对植物的伤害主要表现在细胞脱水、膜系统遭到破坏、酶活性受影响以及胞内物质代谢紊乱等。

植物在长期进化过程中也形成了各种防御机制来抵制这些不利因素对其自身的影响。

胚胎发育晚期丰富表达蛋白（LEA蛋白），作为一类逆境相关蛋白，在植物逆境生理调控过程中发挥着重要作用。

为探索该家族蛋白在植物逆境胁迫中发挥的功能，本论文以LEA蛋白第二家族成员WZY1-2蛋白和第三家族成员WRAB18蛋白为研究对象，对二者在植物逆境胁迫下的功能进行了探讨。

WZY1-2蛋白，为LEA Ⅱ家族蛋白（又称脱水素、脱水蛋白）成员之一，具有该家族典型的保守序列：K片段和S片段，属于SK 3型脱水素，可受多种逆境信号分子诱导表达。

本研究对脱水蛋白WZY1-2及其K、S片段分别缺失的衍生蛋白在植物细胞内的定位和存在形式进行了探讨，确定了WZY1-2蛋白在细胞中的定位及存在形式，并揭示了K片段或S片段的缺失对WZY1-2蛋白的亚细胞定位以及存在形式的影响；通过在大肠杆菌和本氏烟草细胞中对WZY1-2蛋白进行过表达，研究其在干旱、高盐、高温和低温胁迫条件下对原核和真核生物抗逆性的影响。

此外，本研究还通过蛋白与核酸互作的免疫共沉淀技术对脱水蛋白WZY1-2在细胞内的作用机理进行了初步探究。

研究结果如下：
1. 本研究从郑引1#小麦中克隆获得wzy1-2基因ORF序列并在大肠杆菌中进行表达，SDS-PAGE中蛋白大小为理论分子量大小的二倍，通过双分子荧光互补（BiFC）试验进一步证实WZY1-2蛋白以同源二聚体的形式存在于植物细胞。

以wzy1-2基因ORF 序列为模板，利用重叠延伸PCR技术对wzy1-2基因K、S片段分别进行缺失，获得wzy1-2基因衍生物wzy1-2∆K和wzy1-2∆S，对二者分别进行二聚化验证，结果显示，分别缺失了K、S片段的衍生蛋白WZY1-2∆K和WZY1-2∆S在烟草叶片细胞内依然以二聚体的形式存在，该现象表明K、S片段并不影响脱水蛋白WZY1-2的同源二聚化。

2. 分别构建WZY1-2、WZY1-2∆K 以及WZY1-2∆S 蛋白与GFP融合的表达载体，通过在烟草叶片瞬时表达进行蛋白亚细胞定位分析，结果显示，WZY1-2与WZY1-2∆K 蛋白定位于细胞核中。

部分WZY1-2∆S蛋白在细胞核中定位，但也有部分WZY1-2∆S 蛋白定位于细胞内膜和胞质中，由此可见，K片段对WZY1-2蛋白的核定位并无影响，而S片段能够影响WZY1-2的蛋白定位，但并不是决定因素。

3. 将WZY1-2蛋白过表达的大肠杆菌BL21（DE3）菌株与作为对照的转pET28a 空载菌株同时进行干旱、高盐、高温和低温胁迫，通过对比菌株生长状况，证明WZY1-2蛋白能够在逆境条件下提高大肠杆菌的生存能力；构建wzy1-2转基因载体，利用农杆菌叶盘浸染，通过组织培养获得wzy1-2转基因烟草，以野生型烟草为对照，通过对烟草生长表型、根长、发芽率、种子活力以及氧化胁迫相应生理指标进行分析，表明脱水蛋白WZY1-2可在多种非生物胁迫下增强烟草的抗逆性。

4. 利用Ni2+柱对原核表达获得的WZY1-2蛋白进行纯化，并制备特异性抗体进行免疫共沉淀实验，将WZY1-2蛋白与低温胁迫36 h后小麦叶片基因组DNA共同孵育，对琼脂糖珠所捕获复合物分别进行核酸和蛋白电泳检测，结果显示，脱水蛋白WZY1-2能够与核酸结合。

WRAB18蛋白，属于LEA Ⅲ蛋白家族，具有LEA Ⅲ家族保守氨基酸序列（TAQAAKEKAGE）。

本研究确定了WRAB18蛋白在植物细胞内的定位及其在干旱、高盐、高温和低温条件下，对乳酸脱氢酶（LDH）活性的保护作用。

将WRAB18蛋白在大肠杆菌和烟草中进行过表达，探索其在干旱、高盐、高温和低温四种非生物胁迫条件下对原核和真核生物的作用。

同时，本研究克隆获得了WRAB18基因全长及其上游启动子序列，并对启动子序列所包含的顺式作用元件进行分析。

研究结果如下：
1. 构建WRAB18蛋白C端GFP融合表达载体WRAB18-pA7GFP，通过农杆菌菌液注射使GFP::WRAB18融合蛋白在烟草叶片瞬时表达。

在GFP激光通道和mCherry 通道下，利用激光共聚焦显微镜对烟草叶片细胞原生质体中GFP::WRAB18融合蛋白和质体定位蛋白Marker（pt-rk CD3-999）进行共定位观察，结果显示，WRAB18蛋白定位于烟草叶片细胞质体中。

2. 将纯化的WRAB18蛋白与乳酸脱氢酶（LDH）溶液分别在干燥、高盐、高温和低温条件下共同孵育，酶活性分析表明，逆境条件下，含WRAB18蛋白的反应体系中LDH的酶活性明显高于不含WRAB18蛋白的对照组。

3. 将WRAB18蛋白分别在大肠杆菌BL21（DE3）和烟草中进行过表达，对大肠杆菌菌株以及转基因烟草分别进行干旱、高盐、高温和低温胁迫，与对照组进行比较，结果显示WRAB18蛋白的过表达可在多种逆境胁迫下提高原核和真核细胞的抗逆性。

4. 以小麦叶片基因组DNA为模板，克隆获得WRAB18基因的全长序列610 bp，其中包含1个100 bp的内含子区域和2个分别为60 bp、450 bp的外显子区域。

克隆获得WRAB18基因上游2000 bp序列，经Plant CARE Database分析显示，该序列包含TATA-box 和CAAT-box等启动子保守元件，并含有逆境胁迫相关顺式作用元件：ABREs、GARE、LTREs、MBS等。

利用实时荧光定量PCR技术对干旱、高盐、高温和低温四种非生物胁迫后小麦幼苗叶片中WRAB18基因表达量进行分析，结果表明WRAB18基因可受上述4种胁迫诱导表达。

关键词：小麦；非生物胁迫；LEA蛋白；脱水素；亚细胞定位
FUNCTIONAL RESEARCH OF ABIOTIC STRESS-RELATED LEA PROTEINS WZY1-2AND WRAB18IN WHEAT（Triticum
aestivum）
Abstract
Plants always suffer from various stresses, mainly including drought, high salinity, high temperature, the chilling injury, diseases and insect pests, during the whole life span which affect their normal growth. Adversity can harm the cells in numerous ways, even could lead to the death of the plant directly. The injuries of adversity to the plant are as follows: cause cell dehydration, destroy membrane system, affect enzyme activity and lead to intracellular metabolism disorders. Plants have also developed a variety of defense mechanisms to counter the influences caused by the adverse factors in their long-term evolution processes. Late embryogenesis abundant (LEA) protein, as a kind of stress-related protein, plays an important role in plant stress physiology regulation. To explore the functions of LEA protein in plant under adversity conditions, the group 2 LEA protein WZY1-2 and the group 3 LEA protein WRAB18 were considered as the research objects to detect their functions in plants under adversity stresses in this paper.
WZY1-2 protein, as one of the group 2 LEA protein (also known as dehydrin) members, it has the typical conservative sequence of this protein family: K-segments and S-segment, and belongs to the SK3type dehydrins, it can be induced by variety of adversity signal molecules. In this study, the subcellular localizations and existing forms of WZY1-2 protein and its truncated derivatives without K-segments or S-segment in plant cell were detected respectively for the first time, results also showed the influence of lack of the K-segments or S-segment on WZY1-2 protein’s subcellular localization and existing form. Through overexpressed WZY1-2 protein in Escherichia coli and Nicotiania benthamiana, we explored its functions on both prokaryotic and eukaryotic organisms under drought, high salt, high temperature and low temperature conditions. The co-immunoprecipitation assay was carried out to explore the interactions of WZY1-2 protein within the cells. The results of the study are as follows:
1. In this research, the ORF sequence of wzy1-2was isolated from the Zhengyin 1 cultivar of Triticum aestivum and WZY1-2 protein was expressed in Escherichia coli. The molecular weight of WZY1-2 in SDS-PAGE showed a double size of its theoretical value,
Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) approach demonstrated that WZY1-2 was existed in the form of homologous dimers in cells. Considered the ORF sequence of wzy1-2 gene as the template, using overlap extension PCR technology to delete the segment(s) of K, S, respectively, obtained its truncated derivatives without K-segments wzy1-2∆K or S-segment wzy1-2∆S, according to the results of BiFC, truncated derivative protein missing K-segments or S-segment still existed in the form of dimers in the leave cells of tobacco, this indicated that neigher K-segments nor S-segment do work on the dimer formation of WZY1-2 protein.
2. GFP fusion protein expression vectors were built for protein WZY1-2, WZY1-2∆K and WZY1-2∆S, respectively, and expressed transiently in tobacco leave to investigate their subcellular localizations, results showed that WZY1-2 and WZY1-2∆K were localized in the nucleus. Parts of WZY1-2∆S still had the localization in nucleus, while there were amount of WZY1-2∆S proteins localized in the inner membrance and cytoplasm of cells. It followed that the K-segments made no efforts on the nuclear localization of WZY1-2, yet the S-segment involved in WZY1-2’s proper nuclear positioning, nonetheless, it was not the determinant.
3. Overexpressed WZY1-2 protein in strain BL21 (DE3) of Escherichia coli and treated the strains which harbored WZY1-2 protein and empty vectors with four abiotic stresses (drought, high salt, high temperature and low temperature). By measuring the OD value under 600 nm, results indicated that overexpression of WZY1-2 protein could enhance the viability of E.coli during stress conditions. Built a transgenic vector of wzy1-2gene, agrobacterium-mediated semal impregnation method was used to obtain the transgenic tobacco. Wild type tobacco was considered as control, by analyzing the growth phenotype, root length, germination rate, survival rate and stress-related enzymatic activities of tobaccos under different adversity stresses, data showed that overexpression of WZY1-2 increased the stress tolerance of transgenic plants.
4. Using the Ni2 +resin column to purify the WZY1-2 protein expressed from BL21 (DE3) of Escherichia coli, and prepared the WZY1-2 protein antibody to implement the co-immunoprecipitation assay, after incubated WZY1-2 protein with genomic DNA of wheat leave which have been treated under low temperature for 36 h, results showed that WZY1-2 could bind to DNA.
WRAB18 protein, has the conservative amino acid sequence (TAQAAKEKAGE) of group 3 LEA proteins, it belongs to the group 3 LEA protein family. In this study, we explored the subcellular localization of WRAB18 protein in plant cells and the protective effect towards lactate dehydrogenase (LDH) in vitro against adverse stresses including drought, high salinity, and high and low temperatures. Then WRAB18 was overexpressed in both
Escherichia coli and tobacco to explore its function under multiple stresses.In addition, the genomic sequence of WRAB18gene and its promoter sequence were isolated and the sequence analysis was carried out. Results of the study are as follows:
1. A C-terminal GFP recombinant vector was generated to examine subcellular localization of the WRAB18 protein in vivo. The GFP::WRAB18 fusion protein was injected into N. benthamiana leaves and transiently expressed. The fluorescence signals under the 488 nm GFP channel and mCherry channel (pt-rk CD3-999) were observed in protoplast cells under a confocal microscope and indicated WRAB18 localization in the plastids of protoplast cells.
2. Incubated the purified WRAB18 protein with LDH solution under the drought, high salt, high temperature and low temperature stresess, compared with controls, WRAB18 showed greater protection of LDH activity during adversity conditions.
3. Overexpressed WRAB18 protein in both Escherichia coli BL21 (DE3) and tobacco plants, treated the overexpression strains and lanes under drought, high salt, high temperature and low temperature stresses respectively. Results suggested that WRAB18 protein has protective effects in both prokaryotic and eukaryotic cells under various abiotic stresses compared with controls.
4. Based on the full-length cDNA sequence of WRAB18, the 610 bp genomic sequence of WRAB18 gene containing one intron (100 bp) and two exons which length was 60 bp and 450 bp respectively was isolated. In addition,using wheat genomic DNA as template, 2000 bp sequence upstream WRAB18 gene was obtained, PlantCARE Database analysis showed that the sequence contained the promoter conservative elements, such as TATA-box and CAAT-box. It also contained cis-acting elements: ABREs, GARE, LTRE, MBS, etc. The quantitative PCR analysis demonstrated that the transcript accumulation of WRAB18gene occurred in response to drought, high salt, high temperature and low temperature treatments.
Key words: Wheat;Abiotic stress; LEA protein; Dehydrin; Subcellular localization
目录
第一章文献综述 (1)
1.1LEA蛋白概述 (1)
1.2LEAⅡ蛋白简介 (2)
1.2.1 LEAⅡ蛋白特征及分类 (2)
1.2.2 LEAⅡ蛋白的表达及定位 (4)
1.2.3 LEAⅡ蛋白的功能及作用机理 (6)
1.2.4 LEAⅡ蛋白的研究进展 (7)
1.3LEAⅢ蛋白简介 (8)
1.3.1 LEA Ⅲ蛋白特征 (8)
1.3.2 LEA Ⅲ蛋白的表达及定位 (9)
1.3.3 LEA Ⅲ蛋白的功能及作用机理 (11)
1.3.4 LEA Ⅲ蛋白的研究进展 (12)
1.4植物启动子概述 (13)
1.4.1植物启动子结构和功能 (13)
1.4.2 植物启动子研究进展 (14)
1.5本研究的目的和意义 (14)
第二章小麦脱水蛋白WZY1-2及其衍生蛋白的表达和序列分析 (17)
2.1材料 (17)
2.1.1植物材料 (17)
2.1.2 载体与菌种 (17)
2.1.3 主要试剂与仪器 (18)
2.2方法 (18)
2.2.1 植物材料培养 (18)
2.2.2 小麦叶片总RNA的提取和cDNA第一链的合成 (18)
2.2.3 小麦wzy1-2及其衍生基因的克隆 (19)
2.2.4 小麦脱水蛋白WZY1-2及其衍生蛋白的表达 (20)
2.2.5 小麦WZY1-2及其衍生蛋白序列分析 (21)
2.2.6 小麦WZY1-2蛋白的纯化及抗体制备 (21)
2.3结果与分析 (22)
2.3.1 小麦wzy1-2及其衍生基因的克隆 (22)
2.3.2 小麦WZY1-2及其衍生蛋白的表达 (23)
2.3.3 小麦WZY1-2及其衍生蛋白序列分析 (25)
2.3.4 小麦脱水蛋白WZY1-2的纯化及抗体制备 (28)
2.4讨论 (29)
第三章WZY1-2及其衍生蛋白的亚细胞定位及细胞内二聚化分析 (31)
3.1材料 (31)
3.1.1植物材料 (31)
3.1.2 载体与菌种 (31)
3.1.3 主要试剂与仪器 (32)
3.2方法 (32)
3.2.1 植物材料培养 (32)
3.2.2 WZY1-2及其衍生蛋白亚细胞定位载体构建 (32)
3.2.3 WZY1-2及其衍生蛋白亚细胞定位 (33)
3.2.4 WZY1-2及其衍生蛋白BiFC载体构建 (34)
3.2.5 WZY1-2及其衍生蛋白双分子荧光互补试验 (34)
3.3结果与分析 (35)
3.3.1 小麦WZY1-2及其衍生蛋白亚细胞定位结果 (35)
3.3.2 小麦WZY1-2及其衍生蛋白二聚化验证 (37)
3.4讨论 (39)
第四章小麦脱水蛋白WZY1-2在非生物胁迫中的功能分析及作用机理研究 (41)
4.1材料 (41)
4.1.1 植物材料 (41)
4.1.2 载体与菌种 (41)
4.1.3 主要试剂与仪器 (41)
4.2方法 (42)
4.2.1 植物材料培养 (42)
4.2.2 小麦wzy1-2基因的表达特征分析 (42)
4.2.3 小麦脱水蛋白WZY1-2在非生物胁迫下对大肠杆菌的作用 (43)
4.2.4 wzy1-2转基因烟草的获得 (44)
4.2.5 wzy1-2转基因烟草非生物胁迫处理 (45)
4.2.6 脱水蛋白WZY1-2与核酸互作试验 (46)
4.3结果与分析 (46)
4.3.1小麦wzy1-2基因表达规律分析 (46)
4.3.2 小麦脱水蛋白WZY1-2在非生物胁迫下对大肠杆菌的保护作用 (48)
4.3.3 小麦wzy1-2转基因烟草的鉴定 (49)
4.3.4 小麦脱水蛋白WZY1-2在非生物胁迫下增强转基因烟草抗逆性 (51)
4.3.5 小麦脱水蛋白WZY1-2与核酸互作分析 (55)
4.4讨论 (57)
第五章小麦LEA Ⅲ家族蛋白WRAB18序列分析及亚细胞定位 (60)
5.1材料 (60)
5.1.1 植物材料 (60)
5.1.2 载体与菌种 (60)
5.1.3 主要试剂与仪器 (60)
5.2方法 (61)
5.2.1 植物材料培养 (61)
5.2.2 小麦叶片总RNA的提取和cDNA第一链的合成 (61)
5.2.3 小麦WRAB18基因克隆及蛋白表达 (61)
5.2.4 小麦WRAB18蛋白序列分析 (62)
5.2.6 WRAB18蛋白亚细胞定位 (63)
5.3结果与分析 (64)
5.3.1 小麦WRAB18基因克隆及蛋白表达 (64)
5.3.2 小麦WRAB18蛋白序列分析 (65)
5.3.3 小麦不同组织中WRAB18基因表达量分析 (68)
5.3.4 小麦WRAB18蛋白的亚细胞定位结果 (68)
5.4讨论 (69)
第六章小麦WRAB18蛋白在非生物胁迫中的功能分析 (72)
6.1材料 (72)
6.1.1 植物材料 (72)
6.1.2 载体与菌种 (72)
6.1.3 主要试剂与仪器 (72)
6.2方法 (72)
6.2.1 植物材料培养 (72)
6.2.2 小麦WRAB18蛋白在胁迫条件下对乳酸脱氢酶的作用 (73)
6.2.3 小麦WRAB18蛋白在非生物胁迫下对大肠杆菌的作用 (73)
6.2.4 WRAB18转基因烟草的获得 (73)
6.2.5 WRAB18转基因烟草非生物胁迫处理 (74)
6.3结果与分析 (75)
6.3.1 小麦WRAB18蛋白在胁迫条件下对乳酸脱氢酶的保护功能 (75)
6.3.2 小麦WRAB18蛋白在非生物胁迫下对大肠杆菌的保护功能 (76)
6.3.3 WRAB18转基因载体的构建及转基因植株的鉴定 (77)
6.3.4 WRAB18转基因烟草对非生物胁迫的抗逆性分析 (79)
6.4讨论 (83)
第七章小麦WRAB18全长基因和启动子序列的克隆及不同非生物胁迫下的表达分析 (85)
7.1材料 (85)
7.1.1 植物材料 (85)
7.1.2 载体与菌种 (85)
7.1.3 主要试剂与仪器 (85)
7.2方法 (85)
7.2.1 植物材料培养 (85)
7.2.2 小麦叶片基因组DNA的提取 (86)
7.2.3 小麦WRAB18基因全长及启动子序列的克隆 (86)
7.2.4 小麦WRAB18基因全长序列及启动子功能元件的分析 (86)
7.2.5 不同胁迫下小麦WRAB18基因的表达分析 (86)
7.3结果与分析 (87)
7.3.1 小麦WRAB18基因全长及启动子序列的克隆 (87)
7.3.2 小麦WRAB18基因全长序列及启动子功能元件的分析 (88)
7.3.3 小麦WRAB18基因在不同非生物胁迫下的表达量差异 (91)
7.4讨论 (91)
第八章总结与展望 (93)
8.1全文总结 (93)
8.1.1 脱水蛋白WZY1-2研究结论 (93)
8.1.2 WRAB18蛋白研究结论 (94)
8.2展望 (95)
参考文献 (97)
附录 (107)
缩略词表 (111)
致谢 (113)
作者简介 (114)
第一章文献综述
植物在自然界中分布广泛，生长环境复杂，即使在同一地区也常会遭受环境条件的剧烈变化。

当环境变化幅度超出了植物正常生长发育所需的范围时，即成为不良环境因素，又称之为逆境。

逆境种类很多，主要包括干旱、寒冷、高温、涝害、盐碱、病虫害和环境污染等，均对植物的生存与发展造成不利影响。

目前，随着全球气候的变化，植物的生存能力受到严峻的考验，其对不良生存环境的适应机理以及抗逆性作用机制也日渐成为生命科学领域研究的热点(Herrero et al., 2014)。

为了适应环境，更好的生存下去，在长期的进化过程中，植物也逐渐形成了多种防御机制来抵抗不利因素对其生长发育的限制，这些机制广泛的存在于植物细胞水平、分子水平以及整个机体水平。

植物细胞在遭遇逆境胁迫时，会启动相应的应答反应，引起诸如糖类、有机酸、可溶性蛋白、脯氨酸、ABA等物质含量的增加，亦可产生新的蛋白异聚体，或是改变膜脂的成分等来抵御和躲避逆境因素所带来的危害(Bohnert et al., 1995)。

与此同时，植物细胞内也出现了一些能够对逆境胁迫信号进行应答的分子，这些分子能够在植物处于逆境胁迫时，对胁迫相关基因的表达进行调控，引起胞内相应蛋白表达量的增加或减少，从而进一步调控植物抗逆的生理生化过程。

此类蛋白中研究较多的有蛋白激酶、水通道蛋白、胚胎发育晚期丰富蛋白、热休克蛋白、解毒酶类、渗透调节合酶以及相应转录因子等(Shinozaki et al., 2000)。

胚胎发育晚期丰富蛋白（Late embryogenesis abundant proteins，LEA 蛋白）作为逆境胁迫应答分子中重要的一类，在干旱、低温、高温以及高盐等多种逆境条件和种子形成过程中发挥着重要的作用(冯晓昆，2009)。

目前，已有许多LEA蛋白家族成员被研究证实能够被多种逆境条件诱导表达，它们在植物细胞内的积累可以提高植物的抗逆性，但仍有很多LEA蛋白在植物逆境生理中所发挥的具体生理生化功能尚不清楚，作用机理也大多处于推测阶段，缺乏直接的试验证据支持。

因此，本论文选取了LEA蛋白家族中LEA Ⅱ家族蛋白WZY1-2及LEA Ⅲ家族蛋白WRAB18作为研究对象，对二者在植物遭受不同种类非生物逆境胁迫下的功能进行了研究。

1.1 LEA蛋白概述
LEA蛋白，为胚胎发育晚期丰富表达蛋白，分布广泛，最早在1981年被发现于发育中的棉花种子中(Dure et al., 1981)。

随后，LEA蛋白又在小麦、大麦、大豆、玉米、水稻、番茄、葡萄、苹果、拟南芥、马铃薯以及胡萝卜等植物中被陆续发现(Shao et al., 2005)。

近些年的研究显示，LEA蛋白不仅存在于高等植物组织中，并且在细菌、真菌、藻类和微生物以及原生动物、线虫、昆虫、甲壳类动物中也有表达(Shih et al., 2008; Hand et al., 2011)。

LEA蛋白富含极性氨基酸，如甘氨酸、赖氨酸和组氨酸，缺乏丝氨酸和丙氨酸，具有高亲水性和较高的热稳定性，在溶液中处于高度的无序状态，不具备明显的二级结构(Liu et al., 2013)。

LEA蛋白是一个庞大的蛋白家族，根据不同的氨基酸保守结构域，被分为7个亚家族（表1-1）(Battaglia et al., 2008)。

LEA蛋白作为一种逆境响应蛋白，具有协助植物细胞抵抗逆境胁迫的功能，虽然其具体的作用机理尚不清楚，但其作用方式多种多样，已研究发现的LEA蛋白所具有的功能据推测主要集中在以下几个方面：清除植物细胞在逆境条件下产生的活性氧自由基，保护细胞膜和胞内蛋白免受氧化作用影响；结合细胞内由于逆境胁迫所释放出的金属离子，从根源上消除自由基；以类似“分子盾”的形式起到冷冻保护剂的作用；在细胞脱水情况下，通过α螺旋结构与质膜结合，稳定细胞膜结构以防止细胞水分的进一步流失和细胞结构的塌陷；与核酸结合，维持核酸的正确构象从而保证核酸的正确转录翻译。

表1-1 LEA蛋白不同家族的分类及保守结构域(Battaglia et al., 2008)
Table 1-1 Classification and conservative structure of different LEA protein family
1.2 LEAⅡ蛋白简介
1.2.1 LEAⅡ蛋白特征及分类
LEAⅡ蛋白，又称脱水素或脱水蛋白，也称RAB（responsive to ABA）或WSP（water stress protein）蛋白，家族中各脱水蛋白的分子量从9kD到200kD不等(Mundy et al., 1988)。

脱水蛋白通常由80-620个氨基酸组成，含有较高比例的亲水性氨基酸，且富含甘氨酸和赖氨酸，缺乏半胱氨酸和色氨酸，具有高度的亲水性，是一种热稳定蛋白，在
沸水中仍然能保持稳定(Close et al., 1989; Campbell et al., 1997)。

已经发现的脱水蛋白广泛地分布于高等植物、酵母、藻类以及蓝细菌中。

LEAⅡ蛋白家族具有典型的序列特征，其氨基酸序列中至少包含一个富含赖氨酸的K片段（EKKGMDKIKEKLPG），部分脱水蛋白还具有由5-7个多聚丝氨酸组成的S片段以及位于N末端的酪氨酸区Y片段（[V/T]D[E/Q]YGNP）。

K片段通常位于脱水素的C末端，极易形成双亲性的α螺旋结构，构成了其亲水性的结构基础(Allagulova et al., 2003)。

S片段被广泛认为与磷酸化作用密切相关，S片段之后通常跟随有能够与蛋白磷酸激酶结合的DDE或EDD位点。

已有研究表明，玉米脱水蛋白RAB17和拟南芥脱水蛋白ERD14中的S片段可被酪蛋白激酶2磷酸化(Alsheikh et al., 2003; Riera et al., 2004)，并且RAB17蛋白的磷酸化对其结合核定位序列的能力至关重要(Goday et al., 1994; Jensen et al., 1998)。

Y片段中的DEYGNP序列与植物和细菌中部分分子伴侣的核酸结合序列有着高度的相似性，推测其可能参与脱水蛋白与核酸的结合过程(Close, 1996)。

图1-1以玉米脱水蛋白RAB17为例，阐明脱水蛋白典型的序列结构。

图1-1 玉米脱水素RAB17序列结构(Koag et al., 2003)
Fig.1-1 Sequence constructure of dehydrin RAB17 of maize
根据K、S、Y片段的数量及其在氨基酸序列中的位置，被子植物脱水蛋白被分为5种类型：Y n SK2、K n、SK n、K n S以及Y2K n型（图1-2），每种类型的脱水蛋白均有自身特异性的酸碱性及其所响应的诱导因素，表1-2中列举了已报道的不同类型脱水蛋白所具有的酸碱性质以及响应的诱导因素。

此外，部分脱水蛋白的氨基酸序列中还具有保守性较低的Φ片段，该片段大多位于S片段的下游，富含甘氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸(Graether et al., 2014; Rosales et al., 2014)。

图1-2脱水蛋白序列结构(Battaglia et al., 2008)
Fig.1-2 Array of the distinctive motifs in dehydrins
表1-2 脱水素的分类及性质(孙歆等，2005)
Table 1-2 Classification and characterization of dehydrins
1.2.2 LEAⅡ蛋白的表达及定位
脱水蛋白的表达可受多种信号诱导，除了干旱、高盐、高温和低温等非生物胁迫能够诱导脱水蛋白的表达外，外源激素的施加以及病原菌的侵染也可以引起脱水蛋白的大量表达(赵鑫等，2010)。

脱水蛋白在逆境条件下表达量的多少，往往也显示了植株对逆境胁迫抗性的强弱，脱水蛋白高表达的植株通常比表达量较少的植株显示出了较强的抗逆性(Allagulova et al., 2003)。

反之，通过对小麦两个不同抗性品系植株基因表达模式进行分析，结果显示，高抗品系中脱水蛋白的表达量要明显高于敏感植株(Hassan, et al., 2015)。

虽然脱水蛋白的表达受到多种环境因素的影响，但也有一些脱水蛋白能够在正常的生长条件下进行组成型表达，在植物遭受逆境胁迫时提高其表达水平(Rodriguez et al., 2005; Rorat et al., 2006; Jardak-Jamoussi et al., 2016)。

外源ABA的处理会影响脱水蛋白的表达水平，而当植物遭遇逆境胁迫时，往往会引起细胞内ABA含量的升高，因此脱水蛋白最早被简单的认定为是一类ABA响应蛋白，随着Giordani等人发现，在干旱胁迫下，脱水蛋白HaDhn1a在野生植株和ABA缺陷型植株中的表达并无差异，由此证明了脱水蛋白的表达有依赖ABA和不依赖ABA两种途径，这两种途径可通过不同的信号通路来实现脱水蛋白的表达（图1-3）(Giordani et al., 1999)。

部分脱水蛋白在逆境条件下会出现蛋白表达水平与其mRNA含量的变化不一致的现象，在蛋白表达量持续增长的情况下，mRNA的含量在经过短暂的增长后便呈现持
续下降趋势，该现象是由此类脱水蛋白mRNA的半衰期较短而蛋白质半衰期较长引起的，也有人认为这种现象是蛋白翻译效率提高或蛋白质稳定性增强的结果(Artlip et al., 1997; Parmentier-Line et al., 2002; Shu et al., 2004)。

图1-3 脱水素基因表达的信号传导示意图(孙歆等，2005)
Fig. 1-3 Diagram of signaling pathway for the expression of dehydrin genes 脱水蛋白的表达具有明确的组织和器官特异性。

在无胁迫情况下，它们可在植物某特定器官中表达，但当植株遭受逆境时，脱水蛋白便出现在了更多的其他组织或器官中(张楠等，2012)。

如脱水蛋白DHN24，在正常生长条件下，主要在茄属植物的茎、块状茎和根中产生，在叶片中并无表达，但当植物遭遇低温胁迫时，DHN24蛋白在块状茎、转运器官以及顶端组织中的表达量明显增加，同时在叶片中也检测到了表达(Rorat et al., 2006)。

拟南芥中脱水蛋白ERD14和ERD10也存在类似的表达模式(Nylander et al., 2001)。

脱水蛋白通过多种转运方式定位于植物细胞的不同部位，以行使其功能。

采用免疫定位和亚细胞分离技术获得的研究结果显示，脱水蛋白家族成员在细胞核、细胞质和质膜中均有分布(豆玲等，2011)。

研究发现，在冬小麦、冬黑麦和玉米中，两种脱水素相似蛋白（dlps）在线粒体中积累以响应低温胁迫，这两种线粒体定位dlps蛋白的积累程度与植株低温耐受能力呈正相关(Borovskii et al., 2000)。

VrDhn1蛋白，一个以二聚体形式存在的脱水蛋白，免疫定位试验结果表明，其在细胞核和细胞质内均有分布，并且可以与DNA进行非特异性结合，但这种结合能力较弱。

但当外源添加Zn2+或Ni2+时，VrDhn1蛋白与DNA的结合能力显著增强，推测其可能在胁迫条件下参与了稳定核酸结构的过程(Lin et al., 2012)。

表1-3中列举了部分脱水蛋白的亚细胞定位及其所响应的非生物胁迫种类。

表1-3 部分脱水蛋白的定位及其对非生物胁迫的响应(Graether et al., 2014)
Table 1-3 Localization and abiotic stress regulator of dehydrins.
1.2.3 LEAⅡ蛋白的功能及作用机理
植物对非生物胁迫的耐受性是一个非常复杂的生理过程，包括植物发育不同时期的细胞水平和有机体水平上的生理生化过程。

其实质是植物在受到低温、干旱、高温和高盐等非生物逆境胁迫时，能够合成一类高亲水性的蛋白，此类蛋白对自身细胞的核酸、胞内蛋白和膜结构有一定的保护作用，能够稳定细胞膜和许多大分子的结构，避免脱水对细胞造成伤害(Allagulova et al., 2003)。

脱水蛋白的高度保守区域被认为是以氢键连接的大分子，作为一种表面活性剂来防止细胞质在脱水和低温条件下的凝结(Ismail et al., 1999)。

K片段所形成的双亲性的α螺旋结构可以在植物处于逆境时，分别通过亲水作用和疏水作用稳定胞内蛋白的结构。

Brini等人在2010年对脱水蛋白DHN-5所进行的研究显示，DHN-5蛋白能够在高温条件下保护β-葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶的结构稳定性和生物活性(Brini et al., 2010)。

此外，Drira等人在2012年对DHN-5蛋白的两个K片段功能分别进行了具体的研究，将DHN-5蛋白的两个K片段分别敲除进行功能验证，结果显示，保留两个K片段的敲除体可利用其形成的α-螺旋对植物体内如乳酸脱氢酶、β-葡萄糖苷酶等酶类进行保护(Drira et al., 2013)。

也有研究表明，聚胺类物质可以通过钙信使系统和过氧化氢信号途径实现对白车轴草叶片与抗氧化防御机制和脱水蛋白基因相关的耐旱性的调节，由此可见，脱水蛋白对植物抗逆性的作用方式不仅限于直接参与，也可以通过间接调控实现(Li et al., 2016)。