革兰氏染色

思考题
1.革兰染色的基本原理是什么？ 2.大肠杆菌和枯草杆菌经革兰染色后各有什么结果？ 3.革兰染色在微生物学中有何实践意义？
细菌染 色方法
死菌
正染色：
革兰氏染色法
复染色法
抗酸性染色法
（鉴别染色） 芽孢染色法
吉姆萨染色法
负染色： 荚膜染色法
采用两种以上的不同 染料进行先后染色， 可将细菌染成不同的 颜色，以便鉴别细菌。
活菌 用美蓝或TTC等作活菌染色
（2，3，5－三苯基氯化四氮唑）
2.革兰氏染色法
丹麦医生C.Gram(革兰)于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌 的染色方法（复染色）。
革兰氏阳性菌pH2~3，阴性菌pH4~5，加I-－KI媒染，等电点降低，阳性菌降低的更 低，与 结晶紫结合得更牢固；阴性菌结合力弱，易被乙 醇脱色。 （2）与细胞壁有关： G+：细胞壁厚，肽聚糖高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而网孔收缩，故结晶 紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不脱色，仍呈紫色。 G-：细胞壁薄，肽聚糖低，含脂类高，乙醇将脂类分解，缝隙加大，故结晶紫-碘复合物 流出细胞壁，细胞脱色，用碱性红色染色（沙黄）后呈紫色。
水洗，甩干
媒染：卢戈氏碘液染1min
水洗，甩干
染 色
脱色： 95%乙醇脱色约30s 关键步骤！
水洗，甩干
复染： 复红染液染30s
水洗，甩干
自然干燥
油镜观检
2.革兰氏染色法 方法和步骤
革兰氏阳性和阴性细菌
实验注意事项
☆本次实验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。 ☆气溶胶粒径＞100μm沉降很快,＜50μm在0.4s内扩散开,＜5μm通过呼 吸道直接到达肺泡。 ☆实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气 溶胶在空气中扩散引起的。 ☆实验时应坐稳，很专注，不分心，在火焰周围10～20厘米内操作，保 持安静、有序，尽量少说话，以免感染病原菌。
根据此染色法，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌
2.革兰氏染色法 原理
革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁构造的比较
特征 强度 厚度 肽聚糖层数 肽聚糖含量 磷壁酸 外膜 脂肪 蛋白质
G疏松 薄， 5-10nm 少， 1-3层 少(10-20％)
－ ＋
11%-22% 约60%
G+ 坚韧 厚， 20-80nm 多，多达50层 高(50-80％)
实验二 革兰氏染色
1.细菌的染色方法
常用的染色法有： ①简单染色：常用来观察细菌的形态、大小和排列方式。 用一种染液染 色菌体。一般菌体被染上染料的颜色。 ②复合染色法：两种染料染色，以区别细菌的革兰氏染色反应或抗酸性 反应，或将菌体和某一结构染成不同颜色。
1.细菌的染色方法
简单染色法
只用一种染料染色，能清楚观察菌体大小、形 态与排列，不能鉴别细菌。
2.革兰氏染色法 意义
❖ 鉴别细菌：把细菌分成G+和G-两大类。 ❖ 选择抗菌药物：例如G+球菌对青霉素敏感,G-杆菌耐
药。 ❖ 了解细菌的致病机理：G+菌大多产生外毒素,G-菌产
生内毒素。 革兰染色的步骤
涂片 → 干燥 → 固定→ 染色
2.革兰氏染色法 实验器材与材料
接种环接种针，酒精灯，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻 片4张，大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、细菌分离培养物（上次实验平板）， 革兰氏染色液
＋ －
1%-4% 约20%
2.革兰氏染色法 原理
革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁构造的比较
G&#透性学说、等电学说、化学学说
G+菌：
肽聚糖多 交联度大
类脂质少
结晶紫 卢戈碘液液 95%乙醇
复红
G-菌： 类脂质多 肽聚糖少
2.革兰氏染色法 原理
不同细菌的染色差异（G+或G-）是由于细胞壁化学成分的差异而引起了物理特性（脱色能 力）的不同。 具体而言： （1）与等电点有关：
2.革兰氏染色法 涂片的制备
①手持载玻片一端，涂膜朝 上，两个涂膜快速通过火焰 外层3次，时间2～3秒钟。
以玻片触及皮肤热而不烫为度
涂片smear
②促使菌体蛋白质凝固，固定 在载玻片上，以免染色水洗的 时候，细菌被水洗掉。
干燥dry
固定 Fixation
2.革兰氏染色法 方法和步骤
初染：结晶紫染液染 1min
2.革兰氏染色法 涂片的制备
无 菌 操 作
灭菌接种环
2.革兰氏染色法 涂片的制备
①接种环取盐
水3μl×2滴,
水滴间距小于
2cm。
无
菌
②取菌苔少许
（ 1mm 小 菌 落 半 个 ）
操
与盐水混匀，涂成 大于1cm2均匀涂膜。
作
③涂毕→环移至涂膜中 央侧立，待环内菌膜破 裂，接种环烧灼灭菌。
↑↑ 细菌合适 细菌较多