蛋白质的纯化与鉴定-2p

七.其它条件选择
1. 柱的选择 长的层析柱分辨率要比短的高。但层析柱长度不 能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实 验上的一些困难。一般柱长度不超过 1m，为得到 高分辨率，可以将柱子串联使用。 2. 样品的选择： 样品体积占床体积的1-5%, 粘度小。 3. 洗脱液的选择： 完全不带电荷的物质可以用蒸馏水洗脱。带电荷 的物质可以用Tris-HCl、磷酸盐缓冲液，最重要的 要考虑洗脱液对样品的作用，如pH、离子强度、 清洁剂等，是否会引起蛋白分解，影响酶、辅酶、 激素的活性。

Pharmacia
Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel glucose agarose glucose + acrylamide cellulose
■ 各 种 层 析 胶 体 ：
Bio-Rad
BioGel P BioGel A acrylamide agarose


凝胶过滤 （gel filtration）(Porath, Flodin, 1959) 分子筛层析（molecular sieve chromatography） (Hjerté n, Mosbach, 1962) 排阻层析 （exclusion chromatography）(Pedersen, 1962) 指混合物随流动相经固定相的层析柱时，混合物中 各组份按其分子大小不同而被分离的技术。
(七)、凝胶的储存和防止微生物生长 使用中的柱子里，因为有缓冲液的不断流动，微生物 不易生长，未用的柱子和放在容器中的凝胶悬液要采用抗 菌剂预防微生物的生长，抗菌剂必须不与样品作用。 通常用的防腐剂有：叠氮钠 0.02% ，三氯丁醇 0.05% ，硫柳汞 0.005% ，洗必太 0.002% ，汞苯盐（乙酸:硝酸 ）0.001-0.01%。 Sephadex,，Sephacryl,，Sepharose和Sepharose CL都 可以在加防腐剂后以膨胀状态储存。最好在4℃冷藏，但 要防止冻结，因为冻结将破坏凝胶颗粒。 Sephadex可以干燥后储存，干燥的程序是彻底清洗胶 ，除掉盐和杂质，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇 ，平衡后，换稍浓一些的乙醇，依次增加乙醇的浓度，最 后用96%乙醇，使胶皱缩，布氏漏斗抽虑，60-80℃烘干 。
Gel filtration
1. 基本原理 2. 凝胶层析的数理关系 3. 凝胶层析的优点 4. 凝胶层析的缺点 5. 凝胶介质 6. 凝胶类型的选择 7. 其它条件选择
GF v03 Aug 2000 7
一、基本原理
分子筛效应
分子大小不同, 在凝胶受到的 阻滞作用有差 异,从而造成各 组分在凝胶柱 中的迁移速度 不同得到分离。 小分子 被延滯 固 定 相

1/11/2015
4
I. Gel Filtration Chromatography （GFC）
GF v03 Aug 2000
5
Gel Chromatography
Gel filtration is a technique of liquid chromatography which separates molecules according to their sizes.
型号
近似的琼脂糖浓度 (%) 2 4 6
多糖 20×106 5×106 1×106
蛋白质 40×106 20×106 4×106
Sepharose 2B Sepharose 4B Sepharose 6B
3、聚丙烯酰胺凝胶

是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工 成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型 号的凝胶。 使用范围及效果同葡聚糖凝胶相似，但化学性质 较葡聚糖稳定，可在pH 2-11范围内使用.
10
（二）分子量的测定：
球形蛋白质的洗脱体积主要是由它的分子量 决定的，在一个相当的分子量范围内，洗 脱体积大约是分子量对数的线性函数。用 相同形状的和已知的蛋白质作出一条校正 曲线，测定洗脱体积后可从校正曲线得到 分子量。
（三）溶液的浓缩：加入干胶，溶液的水 和小分子被膨胀的凝胶吸收。 （四）去除干扰的小分子：脱盐（盐可被 看作是小分子）、EDTA、生物标记等。
Highly efficient desalting in less than 1 minute
NaCl Albumin
10
20
30
40
50 sec
（五）更换缓冲液：为接下来的实验 更换缓冲液体系
（六）测定平衡常数：例如药物的蛋 白结合率。药物本身分子量较小， 与蛋白结合后成为分子量较大的物 质，通过凝胶过滤将二者分开。
小分子
样品
流 动 相
大分子
较快流出
应用：
（一）纯化：对生物大分子的纯化。如 病毒、蛋白质、酶、激素、抗体、核 酸和多糖等。
Gel filtration purification of an enzyme: SDS-PAGE analysis
M 1 2 3 4 M
67k 43k 30k
M - LMW markers 1 - Start material 2 - Pool from ion exchange 3 - Pool from HIC 4 - Pool from Superdex 75 pg
吸水性 G类的型号 表示每克干凝胶吸 水量（ml）x10 如G-50 每克干凝胶吸 水量为5ml。
2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose， Biogel-A)



由琼脂制成的线性多糖，由D-半乳糖和 3， 6-脱 水L-半乳糖交替组成。 大孔凝胶，工作范围的下限几乎是 Sephadex的 上限，可分离MW40万以上的物质，可用来分离 核酸及病毒 琼脂糖凝胶不带电荷，不受微生物作用而降解 对实验条件要求高(温度＜40℃ ,pH=4.5-9.0)
六、凝胶类型的选择
1. 组分离：当两种成分分子量差距很大时采用， 例如脱盐。凝胶选择使高分子量的洗脱体积在外 水（Vo），低分子量的洗脱体积接近Vt。脱盐 一般推荐Sephadex G-25。 2. 分级分离：当分离几种分子量接近的组分时， 避免几种成分的洗脱体积接近Vo或Vt。 3. 分子量测定：要使样品分子量落在选择性曲线 的线性部分及处于校正标准品的中间。一般推荐 使用Sephacryl S-200 superfine, Sephacryl S-300 superfine或Sepharose CL-6B。

1/11/2015
2
第七部分 蛋白层析的主要技术
蛋白层析的主要技术
Gel Filtration Chromatography (GFC) Ion Exchange Chromatography (IEX or IEC) Affinity Chromatography (AC) Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)
八、凝胶过滤的实验
（一）、凝胶的准备 Sephadex 干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行 ，注意不要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。 不同类型的凝胶膨胀的时间不同： G-25, G-50 膨胀过夜 G-75 一天 G-100 二天 G-200 三天 在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。 Sephacryl, Sepharose, Sepharose CL是膨胀好的。
（二）、装柱
1.
2. 3.
将凝胶悬液调成大约75%。 用负压泵脱气。 如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。 层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温 度变化。 排掉层析床支持物内的气体。 层析柱调到垂直位置。 凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。
4.
5. 6. 7.
（三）、检查层析柱 以蓝葡聚糖2000（2mg/ml）为样品，观察色带在柱 内洗脱时移动的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积 又可作为外水体积。 （四）、加样 1.手工加样 2.加样阀加样 要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。 （五）、洗脱 洗脱装置用蠕动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱 液的供给，不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能 使用。 （六）、凝胶的清洗 凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到上面，影响分 离效果，需清洗后才能恢复原样。 Sephadex,，Sepacryl， Sepharose CL 可用0.2M NaOH 。 Sepharose 可用4<pH<9缓冲液及非离子清洁剂。
(1)Ve = Vo Kd = 0 分子完全被排 阻于凝胶颗粒 之外 全部分布于流 动相里, 最先流出。
(2) 0 <Kd <1 Ve = Vo +ViKd •为溶质以某种程 度向凝胶颗粒内扩 散
(3)Ve = Vo + Vi Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内 部扩散 在两相分配的比值 为1,最后流出.
二、凝胶层析的数理关系
1、柱床体积 (VT) 2、洗脱体积（Ve） 即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗 脱液的总体积。 3、外水体积（V0） 4、内水体积（Vi） 5、凝胶干体积（Vg） 6、分配系数（Kd）
数理关系
外水体积V0
存在于柱床内凝胶 外面空隙之间的水 相体积，相应于一 般层析法中流动相 的体积。
Advanced Biochemistry Fall 2014
Protein Separation and Purification 蛋白质分离和纯化-II
Lecture Outline
蛋白质的分离纯化的基础 蛋白质的分离纯化原则和程序 蛋白质的含量测定 蛋白质纯度鉴定 蛋白质的分离纯化方法 蛋白质层析技术 蛋白层析的主要技术
凝胶干体积Vg 内水体积Vi
颗粒内部所含水相 的体积它可从干凝 胶颗粒重量和吸水 重量相减求得。
柱床体积VT 凝胶体积以及颗粒内 外间隙体积的总和。 VT = 1/4 D2h VT = Vg + V0 + Vi
Void volume Vo
Volume of the gel matrix Vg
Pore volume Vi
Kd=0
0＜Kd<1
Kd=1
洗脱体积
三.凝胶层析的优点
1. 凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳 定。凝胶本身不与样品发生化学反应。 2. 操作条件较温和。用来分离一些理化性质 不稳定的物质。 3. 样品得率高,重复性好,可进行大量样品的 分离纯化。 4. 最快的更换缓冲液
四、凝胶层析的缺点
1. 要求样品和洗脱液的粘度很低。 2. 凝胶颗粒网络孔径大小非常有限 , 所 以可被纯化的物质的分子量范围受到 限制。
（2）特点： 交联度： 交联剂越多 ，交联度越大，网孔结构越紧密。 孔隙愈小，吸水后膨胀也愈小，机械强度高， 分离物质的分子量也小。反之 ,交联剂的百分 比低，分离物质的分子量大。 化学性质： 稳定 , 不溶于水、盐、弱酸、碱和一般有机 溶剂, 耐热耐碱不耐强酸
Sephadex的分级范围
G10 G15 G25 G50 G75 G100 G150 G200 <700 <1,500 1,000 ~ 5,000 1,500~30,000 3,000~70,000 4,000 ~150,000 5,000 ~400,000 5,000 ~800,000
洗脱体积Ve
Concentration
Vo
Ve
Volume
GF v03 Aug 2000
分配系数（ Kd ）：
每个溶质分子在流动相和固பைடு நூலகம்相之间有一 个特定的分配系数（Kd） Ve=Vo+KdVi 特点： （1）与被分离物质分 Ve -Vo 子的大小和凝胶颗粒 Kd = ———— 孔隙的大小有关 Vi （2）与柱的长短粗细 Kd is difficult to get 无关 because Vi is difficult to measure
3. 凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作 用。如芳香族化合物与脂蛋白等。
五、凝胶介质
葡聚糖
（glucose） 琼脂糖 （agarose） 聚丙烯酰胺（acrylamide） 纤维素（cellulose）
1.葡聚糖凝胶
1959年Porath和Flodin合成 （商品名为Sephadex） （1）结构： 基本骨架：葡聚糖（dextran） 交联剂：3-氯代-1 ,2-环氧氯丙 烷使葡聚糖之间通过醚键交联 聚合而成的三维空间网状结构。