QuEchERS-EMR结合超高效液相色谱串联质谱快速检测畜产品中的五氯酚

分析检测QuEchERS-EMR结合超高效液相色谱串联 质谱快速检测畜产品中的五氯酚
李　梁，张建雄*
（唐山市食品药品综合检验检测中心，河北唐山 063000）
摘　要：本研究旨在建立基于QuEchERS-EMR结合超高效液相色谱串联质谱快速、准确测定畜产品中五氯酚的方法。

样品经过乙腈提取，QuEchERS除杂，将离心后上清液通过EMR固相萃取柱净化，0.22 μm 滤膜过滤，上机测定。

五氯酚在1.0～10.0 ng·mL-1线性关系良好，线性系数大于0.99，检测限为0.3 μg·kg-1，定量限为1.0 μg·kg-1。

五氯酚在空白样品加标的低、中、高3个水平添加量下，回收率在80.4%～103.9%，RSD在2.24%～6.46%。

此方法省时便捷、节约成本、准确性好，能够满足大规模畜产样品的测定。

关键词：五氯酚；畜产品；快速检测
QuEchERS-EMR Combined with Ultra-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry for the Rapid Detection of Pentachlorophenol in Animal Products
LI Liang, ZHANG Jianxiong*
(Tangshan Comprehensive Food and Drug Inspection and Testing Center, Tangshan 063000, China) Abstract: This study aims to establish a rapid and accurate method for the determination of pentachlorophenol in animal products based on QuEchERS-EMR combined with ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. The sample was extracted with acetonitrile, impurities were removed by QuEchERS, and the upper clear liquid was purified through an EMR solid-phase extraction column after centrifugation, with a concentration of 0.22 μm filter membrane filtration, machine measurement. The linear relationship within the linear range of 1.0～10.0 ng·mL-1 is good, with a linear coefficient greater than 0.99 and a detection limit of 0.3 μg·kg-1, with a quantification limit of 1.0 μg·kg-1. At the low, medium, and high levels of addition in blank samples, the recovery rate of pentachlorophenol at 80.4%～103.9%, and the RSD at 2.24%～6.46%. This method is time-saving, convenient, cost-effective, and has good accuracy, and can meet the needs of large-scale animal sample determination.
Keywords: pentachlorophenol; animal products; quick detection
五氯酚酸钠属于有机氯农药，曾被广泛应用在除草、杀菌、灭螺等方面。

但由于五氯酚酸钠易溶于水，极易扩散而造成水、土壤污染，也可能进入饲料用植物中，并通过牲畜养殖等食物链作用进入动物体内，所以在动物脂肪、肉、内脏和肉制品中有较高的污染水平，后因其对生物体有毒性作用、在环境中降解困难、持久性污染等特点被禁止使用[1]。

五氯酚酸钠在生物体内以五氯酚的形式存在，在酸性环境下五氯酚酸钠极易转化成化学性质稳定的五氯酚。

由于其结构特性，五氯酚同时具有酚和有机氯的毒性，为确保动物源性食品安全，我国相关法律法规规定，禁止在任何动物性食物中使用五氯酚
作者简介：李梁（1985—），男，河北唐山人，硕士，高级兽医师。

研究方向：农产品质量安全。

通信作者：张建雄（1992—），男，河北唐山人，本科，兽医师。

研究方向：农产品质量安全。

E-mail: 358180374@ 。

Nov. 2023 CHINA FOOD SAFETY 109
分析检测
酸钠[2]。

1　材料与方法
1.1　材料与仪器
鸡肉、猪肉、牛肉，购于河北省唐山市；五氯酚标准品（10 μg·mL-1，天津阿尔塔科技有限公司）；五氯酚同位素标准品（10 μg·mL-1，天津阿尔塔科技有限公司）；甲酸（质谱纯，美国Thermo Fisher 公司）；乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；异辛烷（色谱纯，北京迪马科技有限公司）；EMR净化柱（北京科德诺思技术有限公司）；QuEchERS料包（1g NaCl+4g MgSO4）；其他未做说明的化学试剂均为分析纯（北京迪马科技有限公司）；实验用水为超纯水。

1290-6470B超高效液相色谱串联质谱仪（美国安捷伦公司）、涡旋仪（美国Millipore公司）、精密电子天平（梅特勒—托利多称重设备系统有限公司）。

1.2　试验方法
1.2.1　标准中间溶液配制
移取0.1 mL五氯酚标准品（10 μg·mL-1）至10 mL 棕色容量瓶，用甲醇稀释定容至刻度，配制成100 ng·mL-1的五氯酚标准中间液，有效期3个月。

移取0.1 mL五氯酚标同位素内标（10 μg·mL-1）至10 mL棕色容量瓶，用甲醇稀释定容至刻度，配制成100 ng·mL-1的五氯酚内标标准中间液，有效期3个月。

1.2.2　标准工作溶液配制
取适量五氯酚标准中间液，用空白基质提取液依次稀释成浓度为1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、8.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1的标准物质工作液。

1.2.3　样品前处理
将样品粉碎后，用天平称取5.0 g放入离心管中，加入五氯酚内标中间液0.1 mL，加入5 mL的1%甲酸-水溶液，加入10 mL的乙腈，涡旋5 min，加入QuEchERS料包，用强力旋涡仪涡旋15 min，之后超声5 min，超声完后用离心机4 000 r·min-1离心10 min，将上清液3 mL直接过EMR交换固相萃取柱，收集滤液，混匀，用0.22 μm滤膜过滤，待检测[3]。

1.3　仪器条件
1.3.1　色谱条件
色谱柱为Waters HSS T3（5.0 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流动相：5 mmol·L-1乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）（A）+乙腈（B）；梯度洗脱：0～0.7 min，90%A+10%B；0.7～1.5m i n，10%A+90%B，1.5～3.5m i n，10%A+90%B，3.5～5.0 min，90%A+10%B；流速：
0.4 mL·min-1。

1.3.2　质谱条件
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；干燥气温度：300 ℃；喷嘴电压：500 V；毛细管电压：5 000 V；鞘气流速：11 L·min-1，目标物的MRM采集参数见表1。

表1　五氯酚及其内标物MRM采集参数
目标化合物
母离
（m/z）
子离子
（m/z）
碰撞能
量/eV
去簇电
压/V 五氯酚
262.93535140
264.9*354030
五氯酚-13C6270.9*3535140
注：“*”为定量离子。

1.4　基质效应
按照1.2.3中样品前处理方法制备空白基质提取液。

用UPLC-MS/MS检测五氯酚标准物质工作液，同时使用同浓度系列的五氯酚标准工作溶液绘制标准工作曲线，基质效应判定见表2。

基质效应（Matrix Effect，ME）的计算公式为
ME=k1/k2×100% （1）式中：ME为基质效应，%；k1空白基质溶液配制的标准曲线斜率；k2试剂剂标准曲线斜率。

表2　基质效应判定
范围结果
80%≤ME≤120%基质对信号干扰较弱，
可判定为无基质效应
0%＜ME＜80%；ME＞120%存在基质干扰，
需要考虑消除基质效应2　结果与分析
2.1　前处理条件的优化
2.1.1　QuEchERS料包饱和状态
在空白样品中添加一定量的五氯酚标准品，再分别加入4组不同剂量的料包，观察提取后的水相和有机相是否得到较好的分离，最终通过外标定量来测定五氯酚的回收率。

由图1可知，在2 g NaCl+ 4 g MgSO4这个填料下，五氯酚的回收率最好。

故选择组别2进行试验操作。

2.1.2　提取试剂的优化
在酸性条件下五氯酚酸钠极易转化成化学性质稳定的五氯酚[4]，所以本文在酸性条件下提取五氯酚。

110食品安全导刊 2023年11月（中）
Nov. 2023 CHINA FOOD SAFETY
111
分析检测
同时对0.1%、0.2%、0.5%、1.0%共4种不同浓度的甲酸水溶液进行了研究，在离子化过程中发现酸性过强对提取效果有负面影响，经过反复多次试验，最终确定了加入甲酸水的浓度为0.1%，见表3。

回收率/ %
组别
1代表2 g NaCl 和2 g MgSO 4；2代表2 g NaCl 和4 g MgSO 4；3代表2 g NaCl 和6 g MgSO 4；4代表2 g NaCl 和8 g MgSO 4。

图1　不同NaCl 和MgSO 4剂量组合样品回收率
表3　甲酸浓度优化
添加浓度/（μg·kg -1
）
不同甲酸浓度下的回收率/%0.1%0.2%0.5% 1.0%189.182.178.272.1291.384.277.672.95
90.4
85.4
80.2
74.5
2.2　质谱条件的优化
本文采用同位素稀释法进行定量分析，选用五氯酚-13C 6作为五氯酚的内标物。

在参考五氯酚相关国家标准和参考文献中记录的离子对前提下，通过调节碰撞能量、鞘气和辅助气等参数，对碎裂后的离子碎片进行筛选，对照国家标准选取响应值最大且稳定的碎片离子作为定量离子，选取响应值较大的碎片离子作为定性离子[5]。

试验发现五氯酚在负离子扫描模式下具有最强的响应值，最终确定质谱条件。

2.3　检测限和定量限
添加适量五氯酚标准溶液于空白试样中，使空白添加样品的含量为一定值，经前处理提取净化后供液相色谱-串联质谱仪检测，可以得到目标物。

总离子流图见图2。

本文向空白样品中添加浓度为10 ng·mL -1的五氯酚标准品，通过计算得到理论上
五氯酚在畜产品中的检测限为0.3 μg·kg -1，定量限为 1.0 μg·kg -1。

2.4　标准曲线的绘制
以待测物定量离子质量色谱峰面积与相应内标的定量离子质量色谱峰面积的比值为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制工作液标准曲线，通过此曲线来计算相应数据。

结果表明，五氯酚线性范围在1.0～ 10.0 ng·L -1，线性方程为y =14 386x -6 523.3，线性关系良好，相关系数为0.998 9，满足方法检测要求。

0.5
01Cpd1:wulvfen-NB2.70:-ESIMRMFrag=**************(270.9->35.0)kongbaijiabiao0002..
Noise (Auto-RMS)= 0.009 8;SNR (2.70 min)=142.2
Cpd2:wulvfen2.70:-ESIMRMFrag=**************(264.9->35.0)kongbaijiabiao0002.d
Noise (Auto-RMS)= 0.034 0;SNR (2.70 min)=135.9
1
×10×10×101
1
1
1
1
Cpd2:wulvfen2.70:-ESIMRMFrag=**************(262.9->35.0)kongbaijiabiao0002.d
Noise (Auto-RMS)= 0.009 2;SNR (2.70 min)=120.7
2.702.702.701.0
1.5
2.0 2.5Counts (%)vs.Acquisition Time (min)
3.0 3.5
4.0
1.5
图2　添加浓度为10 ng·mL -1五氯酚的总离子流图
2.5　基质效应
基质效应普遍存在于农兽药残留分析的液质检测方法中，影响目标化合物的准确定量，因此必须采取相应的手段来减少样品的基质效应。

经计算，五氯酚在猪肉中的基质效应为63.5%，存在基质效应干扰，为准确定量，本文采用内标法定量来消除基质效应，提高方法的准确性和重现性。

2.6　准确度和精密度
为了对其精密度和准确度进行考察，设计了高浓度、中间浓度和低浓度3个点的质控样，低浓度选择定量限，中、高浓度选择5倍定量限、10倍定量限。

同时选择3个不同基质（鸡肉、猪肉、牛
肉）。

在每个基质中添加1.0 µg·kg -1、2.0 µg·kg -1、5.0 µg·kg -13个浓度的五氯酚样品，每个浓度6个样品，计算其回收率和批内、批间的变异系数。

由表4可知，五氯酚在低、中、高3个添加量下，回收率在80.4%～103.9%，批内相对标准偏差（Relative Standard Deviation ，RSD ）在2.24%～6.46%，均满足检测方法要求。

2.7　实际样品检测
用本文建立的检测方法在3个月内，共检测畜产品136批，其中检出五氯酚2批，其含量均在本方法检测限以上，定量限以下，故不能准确定量。

因五氯酚在畜产品中不得检出，本方法检出的2批样品已交由相关执法部门继续确证和跟进。

3　结论
本文在QuEChERS 基础上结合直接通过式EMR 固相萃取柱的方式对样品进行前处理操作，在样品种类多、基质干扰大的基质上建立一种以内标法为基础，采用超高效液相色谱-串联质谱测定畜产品中五氯酚的检测方法，并对样品提取、净化和仪器
（下转第134页）
营养与健康
刺激，预防便秘，并减轻胃肠道的负担。

此外，避免刺激性食物的摄入，可以减轻胃肠道的炎症反应，缓解不适症状。

因此，饮食调理对于调整胃肠功能、缓解症状和提高胃肠道健康至关重要。

参考文献
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操作条件进行比较和优化，以期为畜产品中五氯酚残留监测和风险评估提供有效的技术手段。

参考文献
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表4　畜产品中五氯酚的添加回收率、批内和批间精密度
添加浓度/（μg·kg-1）基质
回收率/%
平均回收率/%批内RSD/%批间RSD/% 123456
1.0鸡肉9
2.59
3.39
4.697.791.793.693.9 2.24
5.69猪肉90.787.989.693.188.782.188.7 4.17
牛肉97.8101.4100.791.9103.9100.499.4 4.17
2.0鸡肉94.181.389.39
3.493.683.689.2 6.24
3.95猪肉90.781.685.390.381.190.986.7 5.31
牛肉94.397.798.195.989.986.393.7 5.00
5.0鸡肉91.794.389.49
6.794.980.491.2 6.46
1.95猪肉85.688.887.490.991.684.988.2 3.11
牛肉91.389.788.190.394.194.391.3 2.71
（上接第111页）
134食品安全导刊 2023年11月（中）。