糖蛋白药物的多糖结构解析进展

糖蛋白药物的多糖结构解析进展
刘艳玲;刘晓志;赵伟;王志明
【摘要】细胞表达的治疗性单克隆抗体多数是糖蛋白.附着在蛋白质上的多糖直接影响蛋白质药物的稳定性、生物活性及免疫原性.因此,应对糖蛋白产品上的多糖进行充分分析,以控制产品质量.然而,糖蛋白上多糖的复杂性对检测带了艰巨挑战.介绍了糖蛋白上多糖分析的最新进展,以及利用凝集素芯片技术的高通量多糖分析法,重点介绍了用于检测糖基化位点、糖链结构和含量的测定分析方法,以期为糖蛋白药物的研发提供参考.
【期刊名称】《生物技术进展》
【年(卷),期】2016(006)004
【总页数】5页(P244-248)
【关键词】治疗性糖蛋白药物;多糖分析;凝集素芯片技术
【作者】刘艳玲;刘晓志;赵伟;王志明
【作者单位】华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015
【正文语种】中文
细胞表达的生物技术药物多数是糖蛋白，包括单克隆抗体、重组蛋白、融合蛋白、生长因子、细胞因子、酶和激素。

这些药物被用于癌症、自身免疫性疾病及其他危及生命的疾病的治疗。

适度糖基化对药物的溶解性、稳定性、生物活性、安全性、药代动力学和药效动力学等特征具有重要影响。

药物糖基化不但可以增加药物体外稳定性，还可以保护蛋白药物免受体内蛋白酶的降解。

非糖基化促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)较糖基化EPO，更易受到化学物质、pH变化或是加热引起的变性或降解。

蛋白质糖基化可以影响蛋白药物PK/PD特征，研究显示，末端半乳糖部分糖基化蛋白，较末端唾液酸完成糖基化蛋白具有更短的循环寿命。

由于肝细胞表达的唾液酸糖蛋白受体同半乳糖结合，促进了肝脏对部分糖基化蛋白的清除。

特异性结合末端甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和岩藻糖凝集素样受体，也可以清除含有上述糖基的糖蛋白药物。

此外，Fc片段糖基化对于Fc和Fcγ受体相互作用至关重要。

人Fcγ受体分为激活型受体(FcγRIa、FcγRIIa和FcγRIIIa)及抑制型受体(FcγRIIb)。

Fc片段糖基化影响抗体FcγRs或补体C1q的亲和常数，进而影响其免疫功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis,ADCP)和补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)。

优化Fc 片段的糖基化，可以提高治疗性单克隆抗体的药物活性。

蛋白质糖基化是复杂的翻译后修饰过程，在蛋白特定位点上进行糖基化修饰，通常修饰位点是天冬酰胺残基(N-链接)或是丝氨酸/苏氨酸残基(O-链接)，N-链接糖基化修饰通常发生在Asn-X-Ser/Thr(X是非脯氨酸氨基酸)，O-链接糖基化修饰通常发生在丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基上，通过N-乙酰半乳糖胺(Gal- NAc)和
Ser/Thr的羟基形成O-糖苷键。

蛋白质糖基化过程从内质网开始，将
Glc3Man9GlcNAc2糖链添加到Asn-X-Ser/Thr序列的Asn上。

通过各种糖苷酶修剪，糖蛋白被运输到高尔基体进行下一步修饰。

通过多次催化修饰，形成多种
N-糖链结构，如高甘露糖，复杂、混合糖等结构。

O-链接糖的生物合成，是在高
尔基体内将UDP-GalNAc转化为Gal-NAc，再连接到Ser/Thr残基上。

O-GalNAc前体的起源不同，因此产生了8种O-GalNAc聚糖核心结构，哺乳动物
中常见是其中的4种聚糖核心结构。

蛋白质药物的糖基化通常受到宿主细胞类型和发酵条件(如培养基、pH、温度、搅拌)的影响。

治疗性蛋白药物通常使用哺乳动物细胞、酵母或转基因动物进行生产，每种宿主系统都具有独特的糖基化机制，生产的蛋白药物也具有不同的糖基化模式[1,2]。

哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)被广泛用于治疗性糖蛋白的生产。

哺乳动物细胞表达的蛋白可能含有少量非人源多糖，如高含量甘露糖修饰的N-羟乙酰
神经氨酸(Neu5Gc)和末端α1-3-半乳醣(α-Gal)。

其他表达系统(转基因植物和转
基因动物)可能会产生更多的非人源多糖，如木糖蛋白多糖、Neu5Gc或末端α-Gal，这些多糖的存在可以引起药物的免疫原性反应。

由于复杂的糖基化过程，在糖基化模式上会存在宏观和微观的异质性。

宏观异质性是指糖基化位点和数量的变化，而微观异质性是指在特定位点上的糖链结构的变化。

宏观和微观的异质性有助于产生多样性糖基，虽然其蛋白质氨基酸系列相同，但糖基化位点、糖含量或结构都有可能不同[3]。

治疗性糖蛋白药物糖链异质性的多水平(糖蛋白药物、多糖、单糖水平)分析面临着诸多挑战。

治疗性糖蛋白药物，特别是生物仿制药的研发过程中，通常要联合使用多种方法对其糖基化的性质进行分析，如糖基化位点、糖链结构和数量等。

高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳(CE)、质谱(MS)、等电聚焦(IEF)和凝集素芯片法等方法常被用于完整糖蛋白、糖肽多糖、多糖和单糖分析[4]。

可以直接对完整糖蛋白多糖的一般模式和异质性进行分析。

可以使用电喷雾电离-
飞行时间质谱(ESI-TOF)和反相(RP)的高效液相色谱或排阻色谱(SEC)完成上述检测。

RPLC-MS检测可以为蛋白质检测提供更好的色谱分离，并在检测完整的单克隆抗体时表现出很高的分辨率[大约(150 000±1.5)Da]，但检测过程需要较高柱温(60～80℃)。

虽然，SEC-MS可以使用非变性或变性流动相在室温条件下工作，得到高质量的质谱结果，但是其分辨率比RP低。

LC-ESI-MS可以用于更复杂的治疗性蛋白检测，如促红细胞生成素，这个产品中包括了1个O-糖基化位点和3个N-糖基化位点[5]。

而传统ESI-TOF-MS可以用于分析结构更复杂的异构糖蛋白，如darbepoetin-α(已知含有5个N-糖基化位点)[6]，但在变性条件下检测仍难以完成，最近开发的Orbitrap ExactiveTM 和高分辨质谱仪联用，可以在自然条件下得到高度复杂的高分辨的糖链信息[7]，这项技术的优势在于，使用水性醋酸铵缓冲液对检测蛋白离子化处理，使得蛋白处于无电荷的天然折叠状态。

此外，ESI-MS和MALDI-MS的联合使用可以用于小型完整糖蛋白的多糖分析，但是质谱的分辨率低[5]。

为了提高分析的灵敏度，可以将单克隆抗体药物还原为重链和轻链再进行分析。

常使用二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱胺等还原剂。

另外可以选择木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、IdeZ和IdeS将单克隆抗体降解为更小的片段。

木瓜蛋白酶作用于IgG 铰链区上方，将IgG裂解为3个片段，2个Fab和1个Fc片段，胃蛋白酶作用于IgG铰链区下方，将IgG裂解为F(ab’)2和降解的Fc片段。

IdeZ和IdeS将IgG 裂解为F(ab’)2和一个完成的Fc片段[8]。

也可以CE-MS进行糖基异质性分析。

使用IEF、CE、cIEF或是IEX色谱法，在完整糖蛋白水平上进行蛋白质唾液酸化的异质性分析。

这些方法通常用于质量控制检测；IEF和IEX是传统方法，但与MS不兼容。

CE 和 cIEF是新兴技术具有高速、高分辨率和MS兼容等优势，但毛细血管可能会吸附蛋白质[9]。

利用ESI-MS或MALDI-MS对蛋白质的糖基化位点和占有率进行分析。

可以使用这种方法分析很难从肽链上解离的O-链接糖基。

通过多肽分析，可以检测其他翻
译后的多糖修饰。

用对蛋白质系列高度特异的蛋白酶，如胰蛋白酶、Lys-C或Glu-C，将糖蛋白降解为适当的片段。

再用多种组合方法对片段进行检测，例如对EPO的检测。

糖蛋白质降解形成糖多肽，在MS分析之前，通常使用HPLC对糖多肽进行分类富集，以克服因电离子引起的糖肽信号抑制。

可以通过HPLC和ESI-MS的联合使用实现在线检测，或使用MALDI-MS进行离线检测，现在较为广泛高效使用的LC-ESI-MS可以实现在线检测。

由于共洗脱高丰度糖肽的离子抑制，使用传统
C18柱RPLC-MS分析检测低丰度糖肽时面临诸多挑战。

HILIC可以更好地分离亲水性糖多肽和常规多肽。

但是，具有相同质量糖多肽的异构体不能通过这种方法进行分离。

最近，一种新型纳米LC-MS方法可以用于分离糖多肽异构体。

在包被微流毛细管芯片的多孔石墨碳中，链霉蛋白酶E可以将糖多肽异构体的肽链进行非特异性消化，使肽链的氨基酸残基小于3个，便于糖多肽的分离和检测。

另一方面，发酵过程中Fc糖基化的高通量检测技术得到了发展[10]。

用结合Protein A 96孔板对IgG进行纯化，胰蛋白酶消化糖蛋白， HILIC提取，再进行ESI-MS分析，这种方法可以不使用HPLC对糖多肽进行分离[11]。

单电荷离子产生的MALDI质谱图相对简单，因此MALDI较ESI更适合用于糖肽分析。

但是存在非唾液酸糖肽的衰变对实验的干扰，需要在MALDI-MS分析时对样品进行唾液酸衍生处理。

糖肽串联质谱分析可以测定糖肽上的糖基化位点及多糖组成。

最近开发的电子转移解离(ETD)技术，可以裂解肽键对糖蛋白的糖基化位点进行分析。

而碰撞诱导解离(CID)技术，可以将多糖从糖肽上解离下来，分析多糖的组成和序列信息。

将这些方法组合在一个LC-MS实验中，可以得到有效的糖肽序列信息[12]。

CE-MS可以在糖肽水平上对其特异结合位点的微观异质性进行有效分析。

传统RPLC-MS检测中，高度亲水性肽可能与RP色谱基质发生作用，造成样品在上样
和脱盐过程中的丢失。

因此CE-MS可以更好的用于亲水性多肽检测并实现完整的序列覆盖。

N-糖苷酶F可以将N-链接多糖从糖蛋白上解离下来。

通常使用还原碱性技术将
O-链接多糖从糖蛋白上释放，但是，很难将全部的多糖释放。

MALDI-TOF MS对糖链进行快速鉴定，使用甲基化加强电离的有效性和唾液酸化糖的稳定性。

此外，酯化唾液酸可以增加唾液酸的稳定性，同时可以使用MALDI-MS对不同的唾液酸键(a2-3和a2-6)进行分别检测。

为了方便HPLC和MS的多糖分析，通常使用还原胺化反应对多糖进行荧光标记。

最常用的荧光标记物有：2-氨基苯甲酰胺(2-AB)和氨茴酸(2-AA)。

2-AB缺少负电荷，HPLC是数据库建立的金标准，但是电离效率低。

2-AA带有一个负电荷，适
用于CE和MALDI分析。

最近研究表明，普鲁卡因胺较2-AB荧光标记多糖，具
有更好的电离效率和荧光强度，有利于对应低丰度N-链接多糖的分析[13]。

HPLC 和MS分析前的纯化步骤有利于多余标签和盐的去除，他们包括用于标记检测的HILIC、RP、PGC和凝胶过滤等方法[14]。

使用HILIC、RP-HPLC或阴离子交换HPLC(AE-HPLC)等色谱方法对标记的多聚
糖进行分离。

HILIC较HPLC方法在分离多糖时，表现出更好的分辨率。

2-AB标
记的多糖洗脱同2-AB标记的葡聚糖标准(葡萄糖均聚物)进行比较，葡聚糖标准是
一组葡萄糖聚合数已知的物质标准。

这个信息可以用于计算单糖丰度，预测糖链结构。

另一方面，没有荧光标记的N-糖链，可以通过HPLC同HPAEC-PAD或是PGC色谱联用进行分析，但是方法的耐用性和重复性较差。

荧光标记的解离多糖也可以使用CE进行分析，得到高灵敏度和分辨率的分析结果。

低聚糖CE分析常使用APTS(或2-AA等)作为荧光标记物，可以用于区分糖链结
构的同分异构体。

然而，只有几个多糖标准有相对应的糖链结构CE峰信号。

因此，利用CE对糖苷外切酶顺序消化的寡糖进行分析，可以得到更详细的多糖序列信息。

MS和CE-MS联用可以对肽和糖型特性进行分析，但在寡糖分析中的应用有限。

利用HILIC、CE和HPAEC-PAD等7种方法，对Fc解离的多糖进行分析，各种分析方法得到的糖型和含量结果相似。

由于寡糖异构和支链的存在，对糖链结构的确认带来了挑战。

传统方法是使用糖苷外切酶，将末端的单糖依次解离，再用HILIC、CE或MALDI-MS进行分析。

根据不同糖苷酶实验得到的葡萄糖数目、消化时间和质谱数据变化，推测糖链原始结构对于新糖链结构分析，使用这些方法可以得到有价值的信息，但是方法耗时长，且需要高纯度糖苷酶进行糖链消化[15]。

LC-ESI-CID-MS/MS用于糖链测序，具有速度快、灵敏度高的优势。

使用MS分析糖苷链方式时，需要在负离子模式低能量CID条件下，使用ESI-QTOF MS将糖苷环切开。

但是，MS分析不能解决结构异构体及确定糖链的三维结构等问题。

上述问题可以通过核磁共振(NMR)和结晶X射线等方法解决。

核磁共振被用于新糖链信息结构的确认，但是需要样品量大。

新研发的离子迁移(IM) MS技术，根据分子大小、形状、电荷情况将其电离为气相，增加了检测糖链异构体的有效性。

释放单糖定量分析可以提供特定末端单糖的含量信息，如唾液酸、甘露糖-6-磷酸(M6P)、N-乙酰葡萄糖胺和O-连接单糖。

唾液酸残基可以由温和酸水解或神经氨酸酶特异性的水解。

通常使用HPAEC-PAD对唾液酸进行定量分析。

使用唾液酸标准，可以完成唾液酸的绝对定量。

将唾液酸进行荧光标记后，可以进行RP-HPLC分析。

对于其他单糖，通常使用浓酸水解法再用HPLC进行分离。

特别是唾液酸选择性水解后，通常使用三氟乙酸进行多糖水解，产生的氨基单糖通常被N-乙酰化。

酸水解常见问题是酸性条件下糖链的不完全水解及水解单糖不稳定。

通常使用HPAEC-PAD进行非唾液酸单糖的定性和定量分析，并使用2-脱氧葡萄糖作为这些中性单糖的标准。

凝集素是一组糖结合蛋白(Gbps)，在植物和许多物种中存在，可以选择性地与蛋白质结合的多糖分子或是解离的多糖分子进行相互作用。

基于这种特性，人们开发
了多糖分析方法，基于凝集素芯片开发的几种技术平台，用于治疗糖蛋白药物的多糖分析[16,17]。

特定凝集素被固定到固相载体上(如玻璃载片)，使用化学物质(如环氧、NHS酯、
金或氨基)活化或生物物质(如链霉亲和素)事先将固相载体活化。

凝集素包被后，
使用Tris缓冲液或牛血清白蛋白封闭固相载体上残余的活性位点。

将糖蛋白样品
在检测芯片上同特定凝集素结合，通过洗涤程序去除未结合糖蛋白，再经特定显色技术检测。

这样的操作程序会破坏凝集素和多糖之间的稳态相互作用[15]。

因为相对于抗原-抗体和生物素-亲和素复合物的高结合性，凝集素-多糖复合物的结合性
相对较弱。

近期开发的荧光系统，可在没有洗涤过程的情况下对凝集素-多糖相互
作用进行实时监控[18]。

该检测平台已经应用于检测纯化后的糖蛋白、粗提取膜蛋白、活细胞质膜蛋白质等多种糖蛋白。

有研究比较了3种色谱分析(HPAEC-PAD、2-AA HILIC、2-AB HILIC)和凝集素法用于治疗性单克隆抗体的多糖分析[19,20]。

凝集素法可识别单克隆抗体多糖结构类，检测结果与其他方法一致[21]。

已经有商业凝集素芯片(包含45种不同凝集素)由于检测FDA批准多种治疗性糖蛋白药物(含9种单克隆抗体)。

对于治疗性蛋白质药物检测，凝集素法在检测多糖变异体中具有优势。

MS方法需要涉及较多的样品处理步骤，而凝集素法可直接作用于完整糖蛋白，且需要样品量小。

该凝集素芯片，与精密的检测系统结合后，为治疗性蛋白质药物多糖检测提供了一个快速的高通量平台。

但是凝集素法仍面临挑战，使用凝集素多是天然物质，可与糖蛋白的亲和力弱，阻碍了技术的进一步推广。

蛋白质药物的糖基化复杂性使其分析面临诸多挑战。

糖蛋白类药物的正交方法可用来描述其糖基化特征：①糖含量(中性糖、氨基糖和唾液酸)；②糖链结构，寡糖模式；③糖基化位点。

糖蛋白的检测方法取决于检测目的和方法属性。

IEF、IEX和CE及其组合方法，常用于完整性糖蛋白唾液酸类异质性的检测。

HPLC被广泛用
于检测解离的寡糖含量。

MS-HPLC用于检测糖基化位点和糖结构。

然而，检测低
聚糖前需要将糖链解离；进行检测时，必须保证多糖的有效解离和方法的适当调整，以保证多糖的结构没有太大的改变。

新近发展的凝集素芯片技术，可直接测量完整蛋白多糖的变化，而无需将其从蛋白质上解离，这在蛋白质的糖基化方面，对现有技术是一个有力补充。

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