糖苷酶基因工程及应用

糖苷酶基因工程及应用
糖苷酶即糖苷水解酶(Glycoside hydrolases, GH,EC3.2.1) ,是一类水解糖苷键(glycosidic bonds)的酶,在生物体糖和糖缀合物的水解与合成过程中扮演着重要角色。

糖苷酶在催化糖苷反应时,如果水分子的氧原子进攻受体葡萄糖上的异头碳,即发生水解反应,但如果是葡萄糖羟基上的氧原子进攻受体葡萄糖上的异头碳,即发生转糖基反应。

对其性质和功能的研究一直是生物学和糖生物学关注的热点。

目前已知的糖苷酶大约有2 500 多种,根据序列相似性分为100 多个家族,每一个家族的酶具有相同的空间结构和反应机制。

糖苷酶根据催化作用机制的不同分为两类: 构型翻转酶和构型保持酶,其中,构型保持酶在催化糖苷键水解的同时,还具有转糖基活性,即糖苷键合成活性,该性质使其成为糖类合成的重要工具。

近年来,随着对该类化合物的深入研究,许多糖基化合物需要经改性后才能满足人们的要求,而糖苷酶在这一任务中无疑将扮演重要角色,利用糖苷酶对糖基化合物的糖基定向改造工程成为一个研究热点。

目前有几种常见的糖苷酶：α-甘露糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、壳三糖苷酶、耐高温β-甘露糖苷酶以及硫代糖苷酶等。

这些酶在生物体内和体外都具有重要的作用。

所以研究糖苷酶具有重要的意义。

1.糖苷酶基因工程
糖苷酶可以通过微生物发酵法和提取法得到。

发酵法生产的糖苷酶的微生物主要有黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、节杆菌(Arthrobacter sp.)。

但是，自然界现有的糖苷酶普遍存在着含量少、产酶活力低、产物提取分离与纯化困难、稳定性差、底物特异不高、催化能力低等问题, 从而使得糖苷酶的生产成本高、产量低，远不能满足需求,需要对其进行改造使之更加符合人们的要求。

近年来,随着基因工程、酶工程等现代生物技术的迅猛发展,酶分子的改造取得了辉煌成就,这也成为糖苷酶改造的有力工具。

如可以通过基因工程和微生物工程技术,构建基因工程菌,进行高密度培养,以获得大量的糖苷酶源;还可通过定点突变、体外分子定向进化等方式对天然糖苷酶分子进行定向改造和进化。

值得一提的是,酶分子的体外定向进化技术是改造糖苷酶的一种行之有效的新策略,模拟自然进化进程,通过易错PCR等技术对编码糖苷酶的基因进行随机突变,再由DNA重组、交错延伸过程、随机引导重组、递增截短技术等进行突变基因的体外重组,使基因发生大量变异,并定向选择出所需性质或功能的糖苷酶,从而使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现。

1.1 重组糖苷酶基因的表达
以耐热β-半乳糖苷酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达来具体的阐述。

通过基因工程进行糖苷酶的重组表达的步骤：
①RNA或总DNA的提取；
以嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilis ATCC8005 作为高温乳糖酶基因的供体菌，从中提取基因组DNA。

②引物设计；
pZZ01质粒启动子之后有Kpn Ι酶切位点，但是此位点后还含有枯草杆菌翻译所需的SD序列，所以上游引物合成时需要带上这段SD序列。

上游引物为：5’-ACCGGTACCCAATTCGGAGGTGGAAATGTAATTATGAATGTGTTATCCT C-3’(下划线KpnΙ位点，放抗内为SD位点)；下游引物为5’-TATGGATCCCTAAACCTTCCCGGCTTC-3’(下划线BamH Ι位点)。

③目的片段的扩增及验证；
PCR扩增条件首先为94℃读变性，其次是94℃变性50s，54℃退火50s，72℃延伸4min，循环30次，第三是72℃延伸10min。

④重组表达质粒的构建何鉴定；
以大肠杆菌TGI(supE hsdΔ5thiΔ (lac-proAB)F[traD36proAB+ lacI q lacZΔ M15])用来作为大肠杆菌克隆宿主；枯草芽孢杆菌WB600 (hisΔ nprBΔ nprE18Δ aprEΔeprΔ bpfΔ mpr)作为表达宿主。

以大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pZZ01作为载体。

质粒构建的流程见下图。

按上述PCR方法，扩增得到2Kb左右的片断，胶回收PCR产物，直接KpnΙ、BamHΙ双酶切，纯化酶切产物，同时质粒pZZ01KpnΙ、BamHΙ双酶切，胶回收6.7kb的片断，这2个片断用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，挑转化子提
质粒进行双酶切和PCR鉴定，双酶切鉴定如图
⑥目的蛋白的诱导表达；
在大肠杆菌表达载体中需要IPTG诱导β-半乳糖苷酶的表达，而IPTG比较昂贵。

但是在次表达系统中采用的是组成型质粒，所以不需要诱导。

⑦表达产物的鉴定与活性检测。

收集培养的细胞，提取总蛋白后经过SDS-PAGE电泳鉴定重组β-半乳糖苷酶。

如图：
取1 mL培养液，用细胞破碎机破碎,用于酶的比活力的检测。

除了通过基因重组的方法来提高糖苷酶活性外，还可以通过其他方法获得。

⑴随机突变
用定点突变的方法对糖苷酶进行分子进化,需要了解糖苷酶的结构及活性中心氨基酸的信息。

当这些信息都未知时, 可应用随机突变对糖苷酶分子进行进化。

随机突变虽然筛选工作量大, 但获得的突变酶转糖基活性可大幅度提高,甚至能够获得100%寡糖产量的转糖基酶, 因而也是糖苷酶定向进化的有效方式。

2005 年, Feng等采用错误倾向PCR(errorprone PCR)技术, 对嗜热栖热菌(Thermus ther-mophilus)β- 糖苷酶进行随机突变, 从5000个重组子中筛选出6 种转糖基活性高于天然酶的突变酶, 每种突变酶的酶基因存在1～4 处突变, 对单突变酶的突变氨基酸及多突变酶中共同突变的氨基酸进行饱和突变, 分析
转糖基活性, 结果表明F401 位点与提高转糖基效率密切相关。

突变酶F401S 和F401S/N282T 以邻硝基苯- β- 半乳糖苷为糖基供体, 以麦芽糖为糖基受体生成的β- 1,3- 三糖产量为50%～63%, 以纤维二糖为糖基受体生成的β- 1,3、1,6- 三糖产量为60%～74%, 而天然酶催化同样反应的转糖基产物产量低于8%; 突变酶F401S/N339T 在邻硝基苯- β- 葡糖苷作为底物时, 自转生成的β- 1,3- 二糖产量几乎高达100%,而天然酶的产量只有50%。

随机突变不仅能提高转糖基产物的产量, 还能优化糖苷酶的区域选择性。

Dion 等曾在2001 年报道了嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)α- 半乳糖苷酶(AgaB)的定向进化改变了其区域选择性, 这是首次通过定向进化改变糖苷酶的区域选择性。

AgaB 天然酶以4- 硝基苯半乳糖苷为底物合成的α- 1,3- 二糖与α- 1,6-二糖的比率为0.075。

由于α- 1,3 区域选择性具有很好的生物学和药学意义, 因此尝试用定向进化的方式改变AgaB 的性质, 使其主要具有α- 1,3选择性, 以便用于合成异种移植抗原(Gal- α- 1,3-Gal- β- 1,4- GlcNAc)。

首先采用错误倾向PCR 技术对AgaB 的基因进行随机突变, 在获得的1000个重组子中筛选到22 种蜜二糖(α- 1,6- 二糖)水解活性低、但能水解X- α- Gal 的突变酶, 其中5 种突变酶合成的α- 1,3- 寡糖与α- 1,6- 寡糖的比率为0.34, 大于天然酶的比率。

将这5 种突变酶基因再进行StEP 重组, 在800 个重组子中筛选到10 多种菌株, 所产生的突变酶合成的α- 1,3- 寡糖与α- 1,6- 寡糖的比率为 2.4～9.0, 大大高于天然酶的比率。

随机突变还能优化已经获得的糖苷合成酶,Kim 等采用错误倾向PCR 对来源
于土壤杆菌β- 葡糖苷酶的突变酶Abg E358G 进行了两轮随机突变, 相继得到
两种活性更高的突变酶1D12(A19T、E358G) 和2F6 (A19T、E358G、Q248R、
M407V)。

其中, 2F6 突变酶不仅合成效率最高,而且底物利用的范围也扩大了, 能有效利用α- 氟代木糖, 其A19 和M407 位点的突变改变了酶活性中心的构象, 使酶更易与底物反应。

如：新型突变酶——硫代糖苷酶
微生物糖苷酶来源广泛,种类繁多，有些糖苷酶除具有水解活性外，还具有
转基活性，该性质使其成为糖类合成的重要工具，被用于大规模合成多种O-糖苷。

近三年研究发现，微生物糖苷酶的一类新型突变酶即硫代糖(thioglycoligases)能
催化硫代糖苷(thioglycosides)的合成，这一发现引起了科学家的极大兴趣。

硫
代糖苷是O-糖苷类似物,糖单位组成和空间结构与O-糖苷类似，不同之处仅在于糖苷键通过硫原子起连接作用，不易被糖苷酶水解，具有重要的研究价值：由于化学水解和酶解速率低，可以解决O-糖苷易被内源糖苷酶水解的问题，从而作为
O-糖苷替代品,应用于药物疗法；作为糖苷酶的竞争性抑制剂，与糖苷酶形成稳定的复合物用于X-射线晶体结构分析，研究糖苷酶特异性和作用机制，探索其突变或缺陷引起人类疾病的分子机理;用于制备亲和树脂纯化糖苷酶蛋白；作为非降解性配体用于凝集素研究等。

由于硫代糖苷在生物技术和制药业方面的潜在价值越来越受到关注，相应地,其大量获得也成为当今研究的热点。

⑵ C 端缺失突变和DNA 混编(DNA shuffling)
除定点突变和随机突变外, 采用C端缺失突变和DNA混编技术对糖苷酶进行
基因改造, 也能获得高效转糖基酶, 同时还能改善糖苷酶的酶学性质。

Jorgensen 等在2001 年报道了两歧双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)β- 半乳糖苷酶基因C
端缺失突变的研究。

该酶蛋白分子含有1752个氨基酸, 具有N 端的水解功能域与
C端的半乳糖结合功能域。

C端不同长短DNA 的缺失突变, 产生了一种C 端580个
氨基酸的缺失的酶, 使得正常的具有水解活性和转糖基活性的天然酶变成了一个高效转半乳糖基酶(transgalactosylase), 在乳糖底物浓度10%～40%范围内均表现出转半乳糖基作用: 水解作用=9:1 的高比率, 并且不需要其他特殊的糖苷类物质和任何辅助因子, 表现出一个真正的转半乳糖基酶的特性。

Goyal等在2002 年报道了异源融合嵌合体糖苷酶的研究, 把一株嗜热菌(Thermotoga maritime)产生的具有转糖基活性的耐高温β- 葡糖苷酶(85 ℃)与一株纤维弧菌(Cellvibriogilvus)产生的不具有转糖基活性的中温β-葡糖苷酶(35 ℃)的N 端与C 端不同长短的DNA片段进行DNA混编, 在C 端的混编中, 筛选到2 种转糖基异源嵌合体酶, 其中一种异源嵌合体酶转糖基活性高于亲本酶2 倍, 且耐高温(65～70℃)。

2.糖苷酶的应用
2.1糖苷酶在合成糖苷化合物中的应用
由于糖苷酶的底物适应性很强, 且可以利用非活化的糖作为糖基供体, 被广泛应用于各类糖类化合物的合成。

糖苷酶不仅可以催化形成寡糖, 也可以将直链或芳香的醇糖基化, 还可以催化多肽、萜类、酚类、生物碱以及抗生素等物质的糖基化。

2.1.1 糖苷酶用于寡糖合成
目前糖苷酶的种类逐渐增加, 可以选择不同的糖苷酶催化合成所需的寡糖。

例如糖蛋白N 端连接的三糖的合成, 其中值得注意的一步是以对硝基苯基- N- 乙酰- β- 甘露糖胺苷为供体, N- 乙酰甘露糖胺为受体, 在甘露糖苷酶(来自Asergillus oryzeae)的催化作用下, 合成了很难连接的甘露糖苷键, 形成的N端三糖也是反应中唯一的产物。

Pamela Sears在利用糖苷酶合成低聚糖的过程中, 采用了两种固定化方法,不仅简化了操作难度, 而且酶可以多次利用。

其一,把糖基受体放在固定相中, 糖苷突变酶和糖基供体放在流动相中, 由于低聚糖是线性地从还原端开始逐步合成的, 随着酶液在流动相中流动, 直链糖链被不断地加长, 而不会合成支链糖苷(见下图)。

其二, 把糖苷酶放在固定相中, 糖基受体吸附于水溶性的多聚物上, 糖苷突变酶能通过多聚物催化糖苷键的形成, 随着多聚物在流动相的流动, 直链糖苷不断地被加长(见下图), 最后通过聚合物沉降法, 可以得到纯化的直链三糖和四糖。

2.1.2糖苷酶用于氨基酸和多肽的糖基化
β- D- 半乳糖(1→3)- α- N- 乙酰半乳糖- 1- O- 丝氨酸衍生物是黏液素糖肽的核心结构, 化学法合成十分困难, 需要多步的保护和去保护步骤, 而通过化学- 酶法合成则可使工艺大大简化, 其过程是将α-N- 乙酰半乳糖- 1- O- 丝氨酸的氨基和羧基通过化学法保护后, 在β- 1,3- 半乳糖苷酶的催化下, 以β- 对硝基苯酚半乳糖作为糖基供体, 即可合成β- D- 半乳糖(1→3)- α- N- 乙酰半乳糖- 1- O- 丝氨酸衍生物。

2.1.3糖苷酶用于其他大分子的糖基化
许多有生理活性的大分子都带有糖基, 例如不少抗生素都是糖基化的。

生物大分子的糖基基团与细胞表面的结合有关, 也与其在体内发挥的作用密切相关。

在糖苷酶的催化下可实现单萜烯糖苷的合成,如将香叶醇、橙花醇和香茅醇等的糖基化。

最近Alcaro等发现利用来自原生菌Sulfolobus solfataricus的β-糖苷酶(Ssβ- Gly)将芴酮酯类物质糖基化, 可以增强这类物质的干扰素活性和抗HSV-2
活性, 并能降低这类物质的细胞毒性。

2.2糖苷酶的生物催化和转化
许多天然产物在对人类疾病的治疗中具有重要的药理学意义, 但遗憾的是这些
天然产物本身往往并非最佳活性物质或者无活性或者常常伴随毒副作用。

利用生物转化能诱导惰性底物转化成更具生物活性的化合物, 如利用糖苷酶的生物降
解作用能够使糖苷类化合物生成新的次级代谢产物用以制备有药用价值的同源
化合物, 还可以为天然产物活性筛选提供新的衍生物或先导物, 提高生物活性
物质的发现率。

Yosioka等用柚皮苷酶、杨凌等用酶解人参皂苷Rb1 得到包括Rd、F2、CK在内的一系列次生苷。

国内外许多专家和学者从各种原料中获得了多种葡萄糖苷酶, 鱼红闪等分别从人参根中分离提纯了能水解人参皂苷的β-葡萄糖苷酶和α-呋
喃型阿拉伯糖苷酶用于制备人参皂苷类化合物如Rh2。

柴胡皂甙( Saikosaponin)有a、b1、b2、c 和d等,而柴胡皂甙c的肠道菌部分水解产物prosaikogeninsE-1和E-2具有显著的抗炎活性。

George R. Waller等将各种来源的酶类( 如: 植物的种子和叶、细菌、微生物和肠道菌) 进行水解柴胡皂甙c的筛选, 发现Bac-teroides JY-6 可将柴胡皂甙c 水解为prosaikogenins E-1
和E-2, 他们利用分子生物学的手段克隆了该酶, 以用其进行柴胡皂甙的生物学转化。

2.3 糖苷酶与人工前药
大肠中丰富的糖苷酶为大肠特异性前药的运输提供了条件。

那些亲水性强, 在小肠内吸收不佳的糖苷类化合物一旦到达大肠, 会在糖苷酶作用下水解掉糖苷键生成易被大肠组织吸收的真正药效本体。

其中前者在小肠内几乎完全不被吸收, 而在大肠内有60% 的去掉糖基的类固醇被吸收。

2.4 作为临床检测的指示标识
人体内α－葡萄糖苷酶主要存在于肾上皮细胞刷状缘，属于溶酶体酶。

此酶在血清中含量很微，且分子量较大（＞９０ｋＤａ），不易通过肾小球，因而尿中α－葡萄糖苷酶主要来自肾小管上皮细胞．在各种肾实质疾患及药物中毒性作用等造成肾小管损伤时此酶活性增高，可初步应用于肾损伤的判定。

近年来大量的资料表明血清α-L-岩藻糖苷酶(AFU)是原发性肝癌的标志物和诊断的可靠指标,原发性肝癌病人(PHC) 血清AFU活性不仅显著高于对照组,而且显著高于继发性肝癌、胆管细胞癌、恶性血管内皮细胞瘤、恶性间皮瘤、肝硬化、先天性囊肿和其它良性肝占位病变。

血清AFU 对原发性肝癌诊断的阳性率在64%～84%之间，特异性在90%左右。

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