胶原三股螺旋重复蛋白1在HBV肝病中的临床意义研究

胶原三股螺旋重复蛋白1在HBV肝病中的临床意义研究宋惠;刘兴晖;沈振华;陈庆;徐凤霞;徐莉敏
【摘要】目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)对胶原三股螺旋重复蛋白1(CTHRC1)表达的影响及其临床意义.方法分别采用实时逆转录聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测人肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15中CTHRC1 mRNA和蛋白水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CTHRC1血清学水平,分析非HBV感染的健康人(正常对照组)、无症状HBV携带者、慢性乙型肝炎患者、HBV感染致肝纤维化患者和HBV相关肝细胞癌(HCC)患者中CTHRC1血清学水平的差异.结果HepG2.2.15细胞中CTHRC1 mRNA的表达水平明显高于HepG2细胞;无症状HBV携带者CTHRC1血清学水平明显高于正常对照组(P＜0.05);HBV相关HCC 患者CTHRC1血清学水平明显高于HBV感染致肝纤维化患者和慢性乙型肝炎患者(P＜0.05).结论 HBV能够上调CTHRC1的表达,其血清学水平与HBV疾病进程相关.
【期刊名称】《检验医学》
【年(卷),期】2015(030)011
【总页数】3页(P1104-1106)
【关键词】胶原三股螺旋重复蛋白1;乙型肝炎病毒;肝纤维化;肝细胞癌
【作者】宋惠;刘兴晖;沈振华;陈庆;徐凤霞;徐莉敏
【作者单位】上海市浦东新区公利医院检验科,上海200135;上海市浦东新区公利医院检验科,上海200135;上海市浦东新区公利医院检验科,上海200135;上海市浦
东新区公利医院检验科,上海200135;上海市浦东新区公利医院检验科,上海200135;上海市浦东新区公利医院检验科,上海200135
【正文语种】中文
【中图分类】R446.62
原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种高度恶性的肿瘤，全世界每年有25万人死于此病。

流行病学资料显示，乙型肝炎病毒
(hepatitis B virus, HBV)是导致HCC形成的最主要因素[1]，但HBV的致癌机制目前还不清楚。

胶原三股螺旋重复蛋白
1(collagen triple helix repeat containing 1, CTHRC1)是2005年发现的一个新基因，参与血管的形成和肿瘤细胞的转移，在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用[2-5]。

我们主要探讨了HBV感染对CTHRC1表达的影响，并分析其血清学水平与疾病进程的关系，为揭示HBV的致癌机制和疾病的诊断奠定一定的基础。

一、研究对象
收集临床确诊HBV感染患者369例，其中无症状HBV携带者92例，男52例，女40例，年龄(45±14)岁；慢性乙型肝炎患者106例，男58例，女48例，年龄(47±15)岁；HBV感染致肝纤维化患者94例，男55例，女39例，年龄(51±14)岁； HBV相关HCC患者77例，男48例，女29例，年龄(59±18)岁。

所有患者均排除心、脑、肾等重要器官疾病及其他嗜肝病毒的感染。

正常对照组为126名无HBV感染的健康人，男69名，女57名，年龄(46±20)岁。

二、材料
人肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15由武汉大学典型培养物保藏中心提供；RNA提取试剂TRIzolR购自Invitrogen公司；M-MLV逆转录酶购自美国
Promega公司；荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)引物
由上海英俊生物技术公司合成；荧光定量PCR 试剂盒购自Roche 公司，CTHRC1抗体及其标准品购自美国Santa Cruz公司。

三、方法
1. 人肝癌细胞系HepG2和HepG
2.2.15的培养HepG2 和HepG2.2.15细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的1640培养基，在37 ℃恒温箱维持体积分数为5%的CO2 的条件下培养。

2. 荧光定量逆转录PCR检测CTHRC1 mRNA 采用TRIzolR试剂提取HepG2
和HepG2.2.15细胞的总RNA，逆转录出相应的cDNA后采用
LightCycler 480 荧光定量PCR 仪进行扩增，按照Roche 荧光定量试剂盒说明进行操作，所有反应均设3个复孔。

CTHRC1基因的检测引物为5′-TTCAGTGGCTCACTTCGG-3′(上游引物)和5′-TTCAGGGCTTCCTTGGTC-3′(下游引物)；设β-actin作为内参，引物序列为5′-ATCCACGAAACTACATTCAA-3′(上游引物)和5′-TCTTCATGGTGCTGGGAG-3′(下游引物)。

3. Western blot检测CHTRC1蛋白收集HepG2和HepG2.2.15细胞，加入细胞裂解液，超声破碎后离心取上清蛋白。

分别取样本和标准品30 μg加入等体积
的上样缓冲液后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)
分离，电泳结束后将蛋白转到硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜上，加入抗CHTRC1蛋白抗体，温育洗涤后加入二抗，采用电化学发光(electrochemiluminescence，ECL) 显色系统(君意东方JY-Clear ECL)进行显色。

4. 血清CTHRC1的检测血清CTHRC1检测采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，其水平采用定量方法进行计算。

四、统计学方法
采用SPSS13.0软件进行统计分析。

血清CTHRC1水平以±s表示，2个组之间均数的比较采用t检验，3个组均数比较采用方差分析。

以P<0.05为差异有统计学意义。

一、HBV上调CTHRC1 mRNA和蛋白的表达
HepG2.2.15和HepG2细胞中CTHRC1 mRNA的相对定量分别为0.583±0.082和0.321±0.058，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

HepG2.2.15细胞CTHRC1蛋白的表达量明显高于HepG2细胞，见图2。

二、HBV患者血清CTHRC1水平
无症状HBV携带者CTHRC1水平为(39.7±10.3)ng/mL，HBV感染相关疾病(慢
性乙型肝炎、HBV感染致肝纤维化、HBV相关HCC)患者为(44.8±13.2)ng/mL，正常对照组为(32.6±8.5)ng/mL，三者之间差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

三、CTHRC1血清水平与疾病进程的关系
慢性乙型肝炎患者血清CTHRC1水平为(37.5±9. 3)ng/mL，HBV感染致肝纤维
化患者为(43.3±14.2)ng/mL，HBV相关HCC患者为(51.2±15.8)ng/mL，三者
之间差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

研究表明，全世界累计有3.5亿人感染了慢性乙型肝炎，其中近25%最后发展成
为HCC，慢性乙型肝炎患者HCC发病的危险性要比普通人群高出200倍[1]，我
国肝癌患者80%以上有HBV感染史。

CTHRC1是近年来发现的一种新型分泌型糖蛋白，含有4个外显子和4个内含子，编码243个氨基酸，相对分子质量为15 000～30 000。

研究表明，CTHRC1参
与机体骨的生长修复及血管内膜的损伤修复，调节转化生长因子
β(transforming growth factor beta，TGF-β)的信号发生[6]。

CTHRC1在很多
实体肿瘤中异常高表达，如胃肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、卵巢癌和胰腺癌等，并且与肝癌的预后相关[3，7-9]。

本研究分别在mRNA水平和蛋白水平
探讨了HBV感染对CTHRC1表达的影响。

HepG2.2.15细胞整合了HBV全基因组，是HBV慢性感染重要的细胞模型。

本研究检测了HepG2.2.15和HepG2细胞中CTHRC1的表达情况，结果显示HBV能够在HepG2细胞上调CTHRC1 mRNA和蛋白水平表达；无症状HBV携带者血
清CTHRC1水平明显高于正常对照组，表明HBV感染能够上调CTHRC1的表达。

HBV感染表现形式多样，包括无症状携带、急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化和肝癌。

本研究分析了慢性乙型肝炎患者、HBV感染致肝纤维化患者和HBV相关HCC患者的血清CHTRC1水平。

结果显示HBV相关HCC患者血清CHTRC1水
平最高，其次为HBV感染致肝纤维化患者，慢性乙型肝炎患者最低。

由此可见，随着乙型肝炎疾病进程的发展，血清CHTRC1水平不断升高。

因此，可以考虑将CHTRC1作为HBV相关疾病诊断的辅助指标之一。

研究表明，CTHRC1能够提高癌细胞的增殖和迁移能力，抑制Ⅰ型胶原的合成，
并通过限制胶原基质沉积和促进细胞迁移参与血管的损伤修复和肿瘤的发生、发展过程[5，10] 。

本研究发现HBV能够在细胞水平上调CTHRC1的表达，并且与疾病进程相关。

因此HBV可能通过上调CTHRC1的表达来促进HCC的发生。

但HBV调节CHTRC1表达的具体机制尚待进一步探讨。