白芍HPLC特征指纹图谱的稳定性考察

·色谱指纹图谱研究·
白芍HPLC特征指纹图谱的稳定性考察
黄月纯1，魏刚2，刘翠玲2，冯小权2（1.广州中医药大学第一附属医院，广州510405；2.广州中医药大学，广州510405）
摘要：目的考察白芍特征指纹成分的稳定性，拟定适用性强的白芍特征指纹成分群。

方法采用HPLC法，色谱柱为Zorbax SB-Aq；流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液（梯度洗脱）；检测波长为230nm；流速为1mL·min-1；柱温为35℃。

主要考察不同溶媒与提取方法、不同热处理时间对指纹图谱的影响。

结果共标示出具有代表性的11个共有峰，鉴别了8个成分。

不同溶媒与提取方法对没食子酸、苯甲酸、五没食子酰基葡萄糖影响较大，回流法较超声处理法易促进鞣质类水解生成没食子酸或五没食子酰基葡萄糖、苷类成分水解生成苯甲酸，分析白芍指纹图谱以50%乙醇超声处理法制备供试液较稳定；传统煎煮法易促进鞣质类成分转化为没食子酸，苷类成分水解生成苯甲酸，但鞣质水解程度差异则造成五没食子酰基葡萄糖的稳定性差；随加热时间延长，白芍煎液中儿茶素逐步下降，苯甲酸逐步上升，五没食子酰基葡萄糖先明显上升，然后明显下降。

结论该研究为白芍及含白芍复方煎剂或制剂指纹图谱提供了一定参考。

关键词：白芍；指纹图谱；稳定性；HPLC
中图分类号：R284.1文献标识码：A文章编号：1003-9783（2010）03-0280-05
Stability Consideration of Fingerprint of Radix Paeoniae Alba
HUANG Yuechun1，WEI Gang2，LIU Cuiling2，FENG Xiaoquan2（1.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of CM，Guangzhou510405，China；2.Guangzhou University of CM，Guangzhou510405，China）Abstract：Objective To study the stability of fingerprint of Radix Paeoniae Alba and work out the characteristic group of fingerprint components.Methods HPLC with Zorbax SB-Aq was used，acetonitrile-0.05%H3PO4solution（gradient alution）as a mobile phase and detection wavelength at230nm，flow rate was1mL·min-1，and colum temperature was35℃.The study mainly considers the effect of the different solvents and extraction methods，different heat treatment time on the fingerprint.Results11common peaks were separated，and8components were identificated.The content of gallic acid，benzoic acid and1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose were greater impacted by different solvents and extraction.Tannins with reflux method were more easily hydrolyzed into gallic acid or1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose than with ultrasonic method，meanwhile glycosides were more easily hydrolyzed into benzoic acid.Sample solution of Radix Paeoniae Alba，which was used ultrasonic treatment of50%ethanol，was more stable.Traditional de－coction was easy to promote Tannins hydrolyze into gallic acid，glycosides into benzoic acid，but the low stability of 1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose was caused by the difference of hydrolysis of tannin.With prolonged heating，catechin of the decoction of Radix Paeoniae Alba decreased gradually，benzoic acid gradually increased，1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose significantly increased first and then decreased obviously.Conclusion The study can provide a reference for fingerprint of the decoction pieces，decoction or preparations of Radix Paeoniae Alba. Keywords：Radix Paeoniae Alba；Fingerprint；Stability；HPLC
收稿日期：2009-11-04
作者简介：黄月纯（1968-），女，主任中药师，硕士生导师，主要从事中药质量标准与指纹图谱研究。

Email：huangyuechun@。

通讯作者：魏刚，研究员，主要从事中药新药研究与指纹图谱分析。

Email：weigang021@。

基金项目：广东省科技计划项目（2007B060401010）。

白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lacttiflora Pall.的干燥根，主要含有芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等单萜苷类，没食子酸、苯甲酸等酸类，以及鞣质类等成分。

近年，中药指纹图谱技术逐渐应用于白芍质量控制研究[1-4]，取得一定成效。

但由于研究方法的差异，加上白芍中含一些不稳定的成分，不同的研究方法获得的白芍特征指纹峰也有一定的差异，影响了指纹图谱的应用。

因此，本研究就容易影响白芍指纹图谱稳定性的主要因素进行考察，拟定适用性强、
具有质量代表性的白芍特征指纹成分群，为白芍及含白芍复方煎剂或制剂指纹图谱提供了一定参考。

1仪器与试药
高效液相色谱仪（HP-1100，安捷伦）；二极管阵列检测器（DAD）；没食子酸对照品（批号10831-200302）、儿茶素对照品（批号110877-200001）、芍药苷对照品（批号110736-200933）、苯甲酸对照品（批号100419-200301），均购自中国药品生物制品检定所；白芍饮片，分别购于广东多家药材公司，经广州中医药大学第一附属医院黄月纯主任中药师鉴定，白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根；乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2方法与结果
2.1色谱条件的优化文献[1-4]报道白芍指纹图谱研究采用乙腈-0.05%磷酸溶液（梯度洗脱）流动相系统较好，检测波长为230nm，在此基础上，本研究对流动相系统进行优化（见表1），流速为1mL·min-1，柱温为35℃，进样量为10μL。

表1乙腈-0.05%磷酸溶液梯度洗脱表
2.2不同色谱柱对指纹图谱的影响选择不同厂家的7种型号的C18柱，对50%乙醇超声处理供试液进行分析，结果白芍特征峰的检出峰数与出峰顺序基本一致（见图1），但分离效果有一定优劣差异，苯甲酸由于相对含量低，分离效果较差，确定采用Zorbax SB-Aq 柱。

采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版），以A柱（Zorbax SB-Aq）的指纹图谱为对照，B~G柱的相似度分别为0.977、0.988、0.984、0.966、0.989、0.977。

2.3不同有机溶媒提取对指纹图谱的影响分别精密称取白芍粉末1g，精密加入50%乙醇或50%甲醇25 mL，称重，分别超声处理30min或回流提取1.5h，取出，放冷，用相应溶媒补足减失的重量，取续滤液即得。

依法进样分析，结果50%甲醇回流产生1新特征峰，通过光谱分析与参考文献[1]确认为没食子酸甲酯，其他三种方法的共有峰数一致。

以峰7为参照峰，计算各共有峰面积比值，同时以50%乙醇超声处理的单位生药峰面积为100%计算不同样品共有峰面积提取率，结果见表2，不同供试品溶液的HPLC比较图谱见图2。

以50%乙醇超声处理的指纹图谱为对照，50%乙醇回流、50%甲醇超声、50%甲醇回流的相似度分别为0.988、0.960、0.982。

研究表明采用50%乙醇超声处理制备供试液最稳定。

图2不同提取方法制备供试液的HPLC图谱
A.50%乙醇回流提取法；
B.50%乙醇超声处理法；
C.50%甲醇回流提取法；
D.50%甲醇超声处理法
（*为50%甲醇回流提取法产生的没食子酸甲酯峰）
2.4传统水煎煮法对指纹图谱的影响取6份白芍饮片各12g按传统煎煮法煎煮两次（40、30min），合并两次煎液，放冷，置200mL量瓶中，加水至刻度。

精密吸取煎液4mL，精密加入甲醇6mL，放置2h，超声处理20min，取出，放冷，离心，取上清液置10 mL量瓶中，加60%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

依法进样分析，计算共有峰相对峰面积，同时以50%乙醇超声处理的单位生药峰面积为100%计算水煎液共有峰面积提取率，结果见表3，粉末乙醇超声处理与饮片煎煮法的HPLC图谱见图3。

以50
时间/min 0→20 20→30 30→40 40→45 45→65乙腈/%
5→10
10→13
13→20
20
20→50
0.05%磷酸溶液/%
95→90
90→87
87→80
80
80→50
0.009.4218.8328.2537.6647.0856.4965.91
1690.64
818.27
-54.10
A
B
C
D
E
F
G
图1不同型号色谱柱分析的HPLC图谱
A.Zorbax SB-Aq；
B.Nucleodur Gravity C18；
C.Synergi4u Hydro-RP80A；
D.Eclipe XDB-C18；
E.Hypersil ODS；
F.TSK-GEL ODS-80TS；
G.Luna5u C18（2）
0.009.4118.8228.2237.6347.0456.4565.86
1086.90
537.02
-12.86
A
B
C
D
1
2
3
45
6
7
8
9
1011
*
%乙醇超声处理的指纹图谱为对照，饮片煎煮法的相似度为0.963。

同批次6份饮片不同煎煮次数的相似度大于0.979。

表350%乙醇超声处理与水煎煮的指纹图谱比较结果
图350%乙醇超声处理法与水煎煮法的HPLC图谱
A.50%乙醇回流提取法；
B.水煎煮法
2.5不同加热处理时间对白芍煎液指纹图谱的影响取白芍煎液置500mL玻璃瓶中，加塞压铝盖，分别在沸水中加热0.5、3、6、10h，取出，放凉，按2.4煎液供试液的制备方法操作，进样分析，以原煎液单位生药峰面积为基准，计算共有峰面积变化率，结果见表4、图4，热处理0h、10h的比较图谱见图5。

以
原煎液指纹图谱为对照，热处理0.5h、3h、6h、10 h的相似度分别为0.986、0.993、0.994、0.994。

2.6白芍特征指纹图谱的拟定及应用探讨
2.6.1白芍特征指纹图谱的拟定按前面拟定的色谱条件与供试液制备方法，参照中药指纹图谱研究技术要求进行方法学考察，结果精密度、稳定性、重复性518.19
-4.79
0.009.4118.8228.2237.6347.0456.4565.85
表2不同有机溶媒提取的指纹图谱比较结果
峰号
1 2 3 4 5 6 7（s）8 9 10 1150%乙醇超声
0.1019
0.0224
0.4099
0.0610
0.0486
0.1719
1.0000
0.0119
0.2763
0.0434
0.0107
50%乙醇回流
0.1235
0.0216
0.4058
0.0605
0.0472
0.1717
1.0000
0.0151
0.4631
0.0424
0.0103
50%甲醇超声
0.1029
0.0220
0.4183
0.0617
0.0475
0.1772
1.0000
0.0145
0.0209
0.0432
0.0108
50%甲醇回流
0.1238
0.0221
0.4116
0.0603
0.0493
0.1753
1.0000
0.0175
0.2904
0.0430
0.0108
50%乙醇超声
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
50%乙醇回流
123.99
98.52
101.28
101.51
99.35
102.16
102.30
129.23
171.48
99.97
97.78
50%甲醇超声
101.42
98.65
102.52
101.57
98.01
103.53
100.45
122.49
7.61
100.00
100.56
50%甲醇回流
118.74
96.30
98.14
96.56
99.03
99.64
97.73
143.48
102.73
96.88
98.47
相对峰面积峰面积提取率/%
峰号1 2 3 4 5 6 7（S）8 9 10 1150%乙醇超声
0.1019
0.0224
0.4099
0.0610
0.0486
0.1719
1.0000
0.0119
0.2763
0.0434
0.0107
水煎煮
0.2464
0.0217
0.4679
0.0462
0.0522
0.1814
1.0000
0.0200
0.0444
0.0403
0.0106
50%乙醇超声
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
水煎煮
182.91
73.27
86.37
57.32
81.19
79.83
75.65
126.92
12.15
70.20
74.69
相对峰面积峰面积提取率/%
489.27
-19.55
0.009.4218.8428.2637.6847.1056.5265.94峰号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0.5h
3.76
0.88
-1.98
3.07
-6.91
-3.75
-1.62
-0.69
407.12
-1.04
-2.86
3h
7.34
-9.12
-2.78
-23.45
-12.36
-0.78
-2.01
62.21
305.72
-2.94
0.71
6h
7.30
-9.51
-1.42
-51.49
-7.04
-1.49
-1.39
105.78
226.96
-4.11
-1.12
10h
-5.62
-15.04
-7.14
-79.28
-13.28
-6.87
-7.00
145.84
-87.46
-10.78
-1.78
共有峰面积变化率/%
变化率/%
400
300
200
100
-100
1234567891011峰号
0.5h
3h
6h
10h 表4白芍煎液不同加热处理时间的指纹峰面积变化率注：以原煎液单位生药峰面积为基准。

图4白芍煎液不同加热处理时间的指纹峰面积变化率
图5水煎液与热处理10h的比较图谱
A.白芍原煎液；
B.再热处理10h的白芍煎液
287.08
133.49
-20.10
0.00
10.1320.2630.4040.5350.6660.7970.92
124.00
-3.17
0.00
9.4118.8228.2237.6347.0456.4565.86
均良好。

按《中国药典》2005版一部“白芍”的质量要求，选择芍药苷含量合格的白芍饮片进行分析，结合前面的稳定性试验结果，标示出具有质量代表性的11
个共有峰。

采用对照品定位与光谱对照，鉴定了4个共有峰；参考文献[2-3]，鉴定了4个共有峰；其余3个共有峰均具有与芍药苷相同的紫外光谱。

以峰7（芍药苷）为参照峰计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积，结果见表5，10批样品生成的共有模式见图6，以共有模式为对照，10样品的相似度在0.963~0.990之间。

表510批白芍HPLC 指纹图谱分析结果
注：*为对照品定位鉴别，#为参考文献鉴别。

图6白芍特征指纹图谱共有模式
2.6.2白芍配方颗粒的特征指纹图谱检出试验取白
芍配方颗粒（广东一方药厂产品），研细，精密称取相当含1g 生药的量，按2.3项下拟定的白芍供试液制备方法制备，进样分析，结果白芍配方颗粒能检出白芍的11个特征峰，见图7。

图7白芍配方颗粒的HPLC 图谱
2.6.3含白芍复方煎剂
（四物汤）中白芍特征指纹图谱的检出试验按传统法制备四物汤，按2.5项方法制备供试液，进样分析，结果四物汤能检出白芍的10个特征峰，五没食子酰基葡萄糖峰不稳定，与单味白芍煎
剂结果一致，见图8。

图8四物汤HPLC 指纹图谱
A.四物汤；
B.白芍煎剂；
C.缺白芍煎剂
3讨论
3.1针对白芍的主要成分，文献研究表明50%乙醇或
50%甲醇为溶媒提取效果较好。

但由于白芍中含可水解鞣质等稳定性较差的成分，不同供试液制备的方法而获得的白芍指纹图谱共有峰相对含量也就不稳定。

本研究表明，不同有机溶媒提取方法对没食子酸、苯甲酸、五没食子酰基葡萄糖的相对含量影响较大，对其他成分影响较小。

采用50%乙醇为溶媒，这三种成分的提取率均以回流提取法高于超声处理法为特点，其中五没食子酰基葡萄糖提取率增加71.48%。

曾试验分析50%乙醇超声处理第二次的供试液以考察超声处理一次是否存在不完全的可能，结果表明超声处理一次已基本完全，提示在50%乙醇溶液中，热处理加速了鞣质的水解，生成没食子酸或五没食子酰基葡萄糖，也加速了苷类的水解生成苯甲酸。

而采
用50%甲醇为溶媒，超声处理对五没食子酰基葡萄糖的提取率则很低，回流提取与50%乙醇超声处理相当，提示50%乙醇比50%甲醇对白芍的鞣质水解程度较大。

此外，50%甲醇回流提取产生没食子酸甲酯新特征峰。

综合分析不同的提取条件，采用50%乙醇超声处理法制备供试液分析白芍特征指纹图谱最适宜。

3.2对供试液的纯化问题分析发现，文献[1]采用固相萃取小柱处理，缺失了峰1（没食子酸）、峰2、峰3（芍药苷亚硫酸酯）等特征成分。

白芍煎液供试液制备过程中，曾试验将白芍煎液用不同极性的有机溶媒萃取，结果对峰3（芍药苷亚硫酸酯）的萃取率非常低，而采用煎液加适量乙醇方法制备则能有效地保留特征
成分的含量。

3.3对白芍煎剂指纹分析发现，传统煎煮法易促进鞣质类成分水解生成没食子酸，苷类水解生成苯甲酸，使这两个成分的提取率明显上升，但煎液中五没食子酰基葡萄糖的单位生药峰面积较饮片少，有时几乎不能检出，提示传统煎剂的两次煎煮法，鞣质类的水解
峰号1234567（s ）891011
相对保留时间0.27100.47680.50570.75210.86560.92331.00001.11371.46801.87341.8935
相对峰面积0.1292±0.03240.0287±0.00930.7993±0.25930.0698±0.01260.0402±0.00960.2478±0.05781.00000.0222±0.00810.2666±0.11010.0523±0.00640.0150±0.0030
成分没食子酸*
未知芍药苷亚硫酸酯#
儿茶素*未知芍药内酯苷#芍药苷*苯甲酸
*五没食子酰基葡萄糖#
苯甲酰芍药苷#
未知
λmax/nm
215，275230230282230230230230215，275230230
412.24
-2.350.00
9.41
18.82
28.22
37.63
47.0456.45
65.85
21
3
4
56
7
89
1011
3结论
枇杷叶紫珠的茎叶在岭南地区作为止血中药“紫珠”的主要药用品种之一，有较好的药用历史和基础。

上世纪七十年代，有学者通过理化鉴别认为“紫珠”的止血作用可能与其含有的鞣质成分有关，但并未见有关化学成分研究文献的报道。

为了寻找枇杷叶紫珠止血有效成分，本研究对其地上部分化学成分进行了研究，从其甲醇提取物的正丁醇部位分离得到6个苯乙醇苷类化合物，经理化和光谱分析，分别鉴定为：毛蕊花糖苷acteoside（1），连翘苷forsythosides B （2），肉苁蓉苷C cistanoside C（3），异毛蕊花糖苷isoacteoside（4）、肉苁蓉苷D cistanoside D（5）和独一味苷A lamiophlomioside A（6）。

化合物1~6均为首次从枇杷叶紫珠中分离得到，其中肉苁蓉苷C、肉苁蓉苷D和独一味苷A等3个化合物均为首次自紫珠属中分离得到，丰富了该属植物的化学成分类群，同时为寻找枇杷叶紫珠中的止血活性成分及其作用机制和其他新活性的发现研究提供了物质基础。

参考文献：
[1]裴鉴，陈守良，方文哲，等．中国植物志第65卷第1册[M]．北京：
科学出版社，2004：43-44.
[2]蒋受军，朱斌，魏锋，等.小野芝麻化学成分的研究（Ⅰ）[J].中国
中药杂志，2002，27（9）：671-673.
[3]LU Chunhua，SHEN Yuemao.Water-soluble Constituents from Calli－
carpa pedunculata[J].中国天然药物，2008，6（5）：176-178. [4]李友宾，李军，李萍.臭牡丹苯乙醇苷类化合物的分离鉴定[J].药
学学报，2005，40（8）:722-727.
[5]易进海，颜贤忠，罗泽渊，等.藏药独一味根化学成分的研究[J].
药学学报，1995，30（3）:206-210.
（编辑：修春）
程度不完全一致。

此外，同一批饮片不同煎煮次数的结果差异较大，除火力差异造成的提取率高低外，部分煎液的特征峰面积相对比值有明显差异，特别是芍药苷亚硫酸酯与芍药苷呈现明显的负相关。

根据热处理对白芍煎液的稳定性结果，并未发现芍药苷明显转化为芍药苷亚硫酸酯的特点，因此，芍药苷亚硫酸酯与芍药苷呈现负相关，可能与饮片本身的质量差异有关，提示即使同一批次饮片，质量也可能有较大区别，这种现象与白芍指纹图谱主要分两类相一致[2]，即芍药苷含量很低的样品，芍药苷亚硫酸酯的相对含量则明显偏高。

3.4不同加热处理时间对白芍煎液不同特征峰的单位生药峰面积影响有较大差异，加热0.5h，五没食子酰基葡萄糖的峰面积比原煎液上升了4倍，加热3h、6h峰面积逐步降低，加热至10h峰面积则比原煎液下降了87%，提示随热处理延长鞣质类成分水解完全；没食子酸开始亦呈现上升趋势，然后呈现下降趋势，但总体趋于平衡；儿茶素随加热时间延长，峰面积呈明显的下降趋势，可能是热处理使其分解或转化；苷类成分（峰2，3，5，6，7，10，11）随加热时间延长，含量呈不同程度的下降趋势，但下降幅度在15 %以内；苯甲酸随加热时间延长，含量呈明显的上升趋势，苷类成分逐步水解生成。

同时还考察了白芍粉末加水在不同时间（1.5、3、6、10h）回流的稳定性，结果与白芍煎液热处理结果基本一致。

此外，白芍配方颗粒的苯甲酸相对含量较高，也进一步验证了热处理对白芍煎液指纹图谱的影响。

3.5本文通过对白芍及煎剂特征指纹成分稳定性的考察，拟定了适用性强的白芍特征指纹成分群，基本能在白芍配方颗粒、四物汤中得以重现。

另外，在47min附近有一组峰，具鞣质类光谱，但很不稳定，不宜作为白芍共有峰；五没食子酰基葡萄糖在煎剂中不稳定，含白芍复方煎剂也不宜作为共有峰。

本研究为白芍及含白芍的复方煎剂、复方制剂指纹图谱研究提供了一定的参考。

参考文献：
[1]杨柳，许舜军，田润涛，等．白芍的高效液相色谱指纹图谱研究
[J]．药学学报，2007，42（1）：71-74．
[2]王巧，刘荣霞，于海兰，等．白芍与赤芍HPLC指纹图谱研究[J]．
中国药学杂志，2007，42（8）：581-584．
[3]赫炎，赵慧东，唐力英，等．白芍饮片HPLC指纹图谱的定量标示
研究[J]．中国中药杂志，2007，32（12）：1161-1164．
[4]李越峰，严兴科，沈菲，等．白芍HPLC指纹图谱相似度的分析研
究[J]．中成药，2008，30（7）：942-945．
（编辑：修春）
（上接第279页）。