HPLC-ELSD法同时测定甲壳素降解发酵液中果糖和葡萄糖

HPLC-ELSD法同时测定甲壳素降解发酵液中果糖和葡萄糖章乐;活泼;李成平;叶露;单海峰;饶桂维
【摘要】建立HPLC-ELSD同时测定甲壳素降解发酵液中果糖和葡萄糖含量的分析方法.样品离心分离过滤膜.Prevail Carbohydrate ES柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-水(83∶17),流速0.8 mL· min-1.ELSD漂移管温度:90℃;载气流量:1.5 L/min;进量样10 μL,柱温30℃的条件测定.果糖和葡萄糖含量的线性范围分别为0.115 ～1.152 mg/mL(r＞0.9995)、0.151～1.51 mg/mL,(r＞
0.9998).13个批次的发酵液果糖含量为32.18～135.68 mg/mL,葡萄糖含量为31.66 ～ 119.84 mg/mL.方法简便、准确、专属性强,可用于甲壳素降解发酵液中果糖和葡萄糖含量的质量控制.
【期刊名称】《广州化工》
【年(卷),期】2017(045)008
【总页数】3页(P121-123)
【关键词】高效液相色谱-蒸发光散射法;甲壳素;果糖;葡萄糖
【作者】章乐;活泼;李成平;叶露;单海峰;饶桂维
【作者单位】浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310015;浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310015;浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310015;杭州民生药业有限公司质检中心,浙江杭州311199;瑞安市人民医院制剂室,浙江瑞安325200;浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310015【正文语种】中文
【中图分类】TS254.9
甲壳素(chitin)又称甲壳质、几丁质，最早于1811年由法国学者布拉克诺发现[1]。

在虾、蟹等甲壳类动物中广泛存在，是第二大类天然高分子化合物。

甲壳素为水产加工中的主要副产物，对甲壳素的再加工利用主要是通过甲壳素脱乙酰基生产壳聚糖，进而水解得到各类低聚糖[2-6]。

本课题组在前期的研究中从新疆极端气候土
壤样品中筛选到一组高产脱乙酰基酶活性的嗜热芽孢杆菌[7-8]。

并对该组菌进行
了筛选，发现在以甲壳素为主要碳源发酵96 h后，甲壳素降解完全，发酵液微孔过滤除菌体细胞，再以甲壳素为底物，37 ℃下作用120 h，甲壳素几乎完全降解，产生较多的乙酸。

先前的研究中，都关注发酵液中甲壳素的降解，蔗糖作为发酵常用碳源之一，在甲壳素的降解中的应用几未见报道，本实验添加适量蔗糖作为碳源，对其降解为果糖和葡萄糖的情况进行研究。

本实验对13批次的降解液中的果糖和葡萄糖含量进行了测定，以期对筛选高产具有脱乙酰基酶活性和甲壳素降解酶活性菌种提供帮助。

1.1 材料
甲壳素发酵液，实验室自制。

1.2 试剂和设备
果糖和葡萄糖标准品(纯度≥95%，购至阿拉丁)，乙腈为HPLC级，水为超纯水，其余皆为分析纯。

Agilent1100液相色谱系统，包括在线脱气机、四元泵、自动进样器，美国Agilent公司；ELSD3300蒸发光散射检测器，美国Alltech公司；GL-20G-Ⅱ台
式告诉冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；KQ-300GVDV型三频恒温数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DF-101B集热式磁力加热搅拌器，金坛市国
旺实验仪器厂；UPWS超纯水器，杭州永洁达净化科技有限公司。

2.1 对照品溶液的制备
精确称取果糖与葡萄糖对照品适量，加水制成每1 mL含有1 mg的混合混合溶液，摇匀，即得。

2.2 供试品溶液得制备
取降解发酵液5 mL，置10 mL具塞刻度塑料离心管中，1000 rpm离心10 min，取出，上清液过0.22 μm滤膜过滤，即得到样品。

2.3 色谱条件
色谱柱：Prevail Carbohydrate ES柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美国
GRACE_Alltech公司)；流动相：乙腈-水(83:17)；流速：0.8 mL/min；柱温：
30 ℃；ELSD漂移管温度：90 ℃，雾化气流速：1.5 mL/min；增益系数：16。

该色谱条件下，果糖与葡萄糖的色谱峰完全达到基线分离(R>2)。

3.1 线性关系考察
在2.3色谱条件下，将配制好的0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1. 0 mg/mL的单糖(果糖、葡萄糖)标准工作溶液分别用所建方法进行测定，以单糖的色谱峰面积对数(Y)为纵坐标，质量浓度对数(X,mg/mL)为横坐标，进行线性绘制，得到果糖标准
曲线回归方程为：Y=1.4343x+4.583，r=0.9995,果糖含量测定的线性范围为
0.115～1.152 mg/mL；葡萄糖标准曲线回归方程为：Y=1.478x+4.5039，
r=0.9998,葡萄糖含量测定的线性范围为0.151～1.51 mg/mL。

3.2 精密度试验
取单糖标准品溶液0.5 mg/mL适量，按2.3项下色谱条件进行6次含量测定，记录峰面积，计算峰面积测定结果的相对标准偏差，结果见表1、表2。

结果表明，该方法具有良好的精密度和准确度。

3.3 稳定性试验
取单糖标准品溶液0.5 mg/mL适量，按2.3项下色谱条件下分别在0、2、4、8、12、24 h下进行含量测定，记录峰面积，计算峰面积测定结果的相对标准偏差，
结果见表3、表4。

结果表明，该方法具有良好的稳定性。

3.4 加样回收率试验
取未加蔗糖的降解发酵液样品作为空白样品，进行加标回收试验[13]。

取9份分别加入约5，7.5，10 mg 3个水平的果糖和葡萄糖对照品，每个水平平行测定3次，按照2.3色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表5、6。

3.5 样品含量测定
取13个不同量蔗糖碳源的降解发酵液，用本实验方法测定其中果糖和葡萄糖的含量。

结果见表7。

蔗糖水解为果糖及葡萄糖的比例约为1:1，测定的13批次降解
液果糖和葡萄糖含量接近也印证了这一点。

本实验对甲壳素降解液中的果糖和葡萄糖含量建立了HPLC-ELSD测定方法。

得到了较佳的测定色谱条件为：色谱柱：Prevail Carbohydrate ES柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美国GRACE_Alltech公司)；流动相：乙腈-水(83:17)；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；ELSD漂移管温度：90 ℃，雾化气流速：1.5 mL/min；增益系数：16。

在该色谱条件下，降解液中的果糖和葡萄糖平均回收率分别为126.9%、99.1%，RSD 分别为7.1%、6.9%(n=9)，本方法前处理较为简便，测
定准确度高、重现性好、专属性强，可作为后续研究甲壳素降解液中果糖和葡萄糖含量的常规测定方法。

从实验可初步看出，该酶具有多向选择性，对除甲壳素外的其他炭源亦有降解活性，但基于酶降解的复杂性，对该酶降解作用中酶的作用机理还需进一步深入研究。

【相关文献】
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[4] 施文涛,陈鹏.甲壳素酰化改性的研究进展[J].化工进展,2016,35(7):2166-2172.
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