小麦优质Axl/Ax2*和Dx5亚基的二重AS-PCR分子鉴定

小麦优质Axl/Ax2*和Dx5亚基的二重AS-PCR分子鉴定
作者：孙宪印，吴科，钱兆国，等
来源：《农学学报》 2013年第5期
孙宪印1,2，吴科1，钱兆国1，米勇1，牟秋焕1，郭营1，李斯深2（1山东省泰安市农
业科学研究院，山东泰安271000；2山东农业大学农学院，山东泰安271018）
摘要：为了提高小麦Glu-A1 位点Ax1/Ax2*亚基和Glu-D1 位点Dx5 亚基分子标记鉴定效率，方便小麦分子水平的辅助选择及品种评价，建立了小麦高分子量谷蛋白Ax1/Ax2*亚基及
Dx5 亚基基因的二重AS-PCR反应体系。

结果表明，PCR鉴定结果与SDS-PAGE电泳结果一致。

利用建立的二重AS-PCR稳定扩增体系鉴定了21 份外引小麦品种系的谷蛋白Glu-A1 及Glu-D1 位点，有7 个品种扩增出1500 bp 特异片段，表明具有Ax1/Ax2*亚基；有11 个品种扩增出
478 bp 特异片段，表明具有Dx5 亚基；小麦优质Ax1/Ax2*亚基和Dx5 亚基出现百分率分别为33.3%和52.4%。

该反应体系扩增稳定，可同时鉴定Ax1/Ax2*亚基及Dx5 亚基，适用于优质小
麦新品种的辅助选择。

关键词：小麦；高分子量谷蛋白亚基；二重等位基因特异性PCR
中图分类号：S512.1 文献标志码：A 论文编号：2013-0081
0 引言
小麦高分子量谷蛋白亚基Glu-A1 位点上存在3种等位基因变异（1、2*和Null）。

Glu-D1 位点上存在6种等位基因变异（编码8 种不同多肽：2、3、4、5、10、12）。

不同品种HMW-GS 组成和表达量的不同与品种间加工品质的差异存在密切相关性，据此，Payne 首先建立了小麦
高分子量麦谷蛋白亚基对面筋品质贡献的评分系统[1-3]，如Ax1/Ax2*和Dx5 是目前国际公认
的面包小麦优质亚基。

但是针对中国现有品种的亚基组成情况，国内多数学者认为中国尤其缺
少优质品质亚基：5+10 亚基和2*亚基。

马传喜等[4]的研究表明，中国小麦品种1D 染色体上
的5+10 亚基和1A 染色体上的1或2*亚基出现的频率较少，而2+12 亚基（1D 染色体）和1A 染色体对应的缺失(Null)的品种出现的频率相对较高，这被认为是中国小麦品种面包烘烤品质
较差的重要原因之一。

毛沛[5]的研究结果也证明，在小麦高分子量谷蛋白亚基中，5+10 亚基
在国内的小麦品种资源中出现的频率很低，1、2*等赋予面团较强弹性的亚基都有不同程度的缺乏，尽管在国内的小麦育成品种中1、2*亚基占有一定的比例（分别为27.6%和1.5%），但这
与国外相比还有一定的差距。

赵和等[6]的研究结果与以上两位学者的结论相类似，国内品种中Glu-1 的3个位点HMW-GS 的出现频率较高的是：Null 亚基(66%)、7+8 亚基(54%)、2+12 亚
基(80%)，他也认为优质亚基1、2*，尤其是5+10 亚基出现频率较低是中国小麦面包烘烤品质
较差的主要原因。

综上所述，改良中国小麦品质应引进具有优质亚基且遗传配合力较好的品种，提高优质亚基在中国小麦品种中的频率非常有必要。

目前，已有利用分子标记对小麦谷蛋白亚基进行鉴定的报道[7-12]，其中针对Glu-1A 位
点的分子标记，国内报道的多重PCR体系仅分别涉及Glu-A1 位点上的Null、1 和2*亚基位点[7-10]，未见利用特异性扩增Ax1/Ax2*亚基的引物用于分子标记体系的报道。

本实验建立起稳
定的Ax1/Ax2*和Dx5 亚基的二重PCR 反应体系，利用SDS-PAGE电泳验证了其分子鉴定结果的
可靠性。

对21 个外引品种（系）进行了Ax1/Ax2* 和Dx5 亚基的分子标记鉴定，确定了外引
品种（系）中Ax1/Ax2*和Dx5 亚基的分布情况，将有利于了解材料优质亚基组成和选配杂交组合及后代的标记辅助选择，加快小麦品质育种进程。

1 材料与方法
1.1 材料
实验所用材料为山东农业大学小麦遗传育种教研室搜集的国外品种（系）21 份。

对照为Neepawa(2*，7+9，5+10)，Marquis(1，7+9，5+10)和‘中国春’(Null，7+8，2+12)，用于二
重AS-PCR 鉴定结果和SDS-PAGE电泳的比较分析。

实验所用扩增仪为德国产Biometra梯度型PCR仪。

1.2 基因组DNA的提取
在小麦苗期，取叶片用于DNA的提取，提取方法参照Marcin等[13]的方法并稍加改动。

1.3 PCR标记体系建立
Ax1 和Ax2* 亚基的特异性引物序列主要参照Marcin 等[13]的方法，Dx5 亚基的特异性引物序列主要参考Ma 等[14]的方法，引物序列及扩增片段长度见表1，引物由上海生工生物工程公司合成。

AS-PCR 反应体系调整为：25 μL体系中加入模板DNA 180 ng，Ax1/Ax2*亚基引物105 ng，1Dx5 亚基引物75 ng，MgCl2终浓度为1.8 mmol/L，dNTP 终浓度为0.25 mmol/L，10 倍PCR buffer 2.5 μL，Taq DNA聚合酶1.5 U。

AS-PCR 反应条件为：95℃预变性3 min，然后94℃
变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环35次；最后72℃延伸10 min。

扩增产物的电泳检测：在1.7% TBE缓冲液中，用1.5%琼脂糖凝胶进行AS-PCR产物条带分离，在120 V电压下电泳60 min 后，取出凝胶在紫外灯下观察。

并在凝胶成像系统(Tanon
GIS2010)中照相（采用TanonGIS MP照相软件），采用天能GIS 凝胶图像处理系统分析PCR产
物片段。

1.4 HMW-GS的SDS-PAGE电泳
按张学勇等[15]的方法进行SDS-PAGE电泳，分析HMW-GS的组成。

2 结果与分析
2.1 SDS-PAGE 电泳和二重AS-PCR 标记结果之间的比较
选用3 个HMW-GS 组成已知的材料，Glu-A1 位点包含所有亚基变异类型，既有Axnull 基
因（如‘中国春’CS），又有Ax1 基因（如Marquis）和Ax2* 基因（如Neepawa）。

其中Marquis和Neepawa均含有Dx5 亚基，Marquis 和Neepawa 均扩增出的1500 bp 和478 bp，
而‘中国春’无扩增条带。

3 个小麦品种Glu-A1 位点和Glu-D1 位点HMW-GS 组成的PCR 扩增结果与其SDS-PAGE电泳结果一致（表2）。

2.2 Ax1/Ax2*亚基和Dx5 亚基基因的二重AS-PCR
采用Ax1/Ax2*亚基和Dx5 亚基的等位基因特异性引物的分子标记，对21 个国外小麦品种（系）的Glu-A1 位点和Glu-D1 位点的亚基组成进行了分析（图1）。

从图1 可以看出，在电泳图谱1500 bp 的位置上和478 bp 的位置上扩增条带的有无非常清楚。

在阳性对照Neepawa
和Marquis 上均扩增出2 条带，明显表示在Glu-A1 位点和Glu-D1 位点有优质亚基，阴性对
照‘中国春’在 2 个位置均无明显条带，表示在Glu-A1 位点和Glu-D1 位点不存在优质亚基。

另外，21 个国外品种Glu-A1 位点和Glu-D1 位点优质亚基的组成情况也十分明显。

在21 份
外引小麦品种（系）的麦谷蛋白Glu-A1 及Glu-D1 位点上，有7 个品种扩增出1500 bp 特异
片段，表明该品种具有Ax1/Ax2*亚基；有11 个品种扩增出478 bp 特异片段，表明该品种具
有Dx5 亚基；小麦优质Ax1/Ax2*亚基和Dx5 亚基出现百分率分别为33.3%和52.4%。

优质高分
子量麦谷蛋白亚基的二重AS-PCR 分子标记，可以在同一反应体系中同时鉴定Glu-A1 位点和
Glu-D1 位点的Ax1/Ax2*亚基和Dx5 亚基，提高了分子标记鉴定效率，一次PCR 反应就可以提
供品种优质亚基组成的更多信息。

3 结论与讨论
二重PCR与单重PCR不同，根据反应体系的构建过程，一般应注意扩增条带大小、引物浓度、退火温度和延伸反应时间的确定等问题：（1）特异性引物在反应体系中扩增产物差异较大，在琼脂糖凝胶电泳中容易区分，如本实验中Ax1/Ax2*和Dx5 优质亚基的扩增条带分别为1500 bp 和478 bp。

（2）根据电泳中条带的强弱适当调整引物浓度。

对扩增条带较弱的基因适当增
加其引物用量，而较强的减少其用量，通过不断调整引物的相对用量，可获得较好的电泳图谱。

如本实验中Dx5 亚基扩增条带相对明显，Dx5 亚基的引物浓度仅为Ax1/Ax2*亚基引物浓度的71.4%。

（3）选择合理的退火温度，进行退火温度的梯度PCR 反应，以确定最佳的退火温度，
减少引物和模板间的非特异性结合，确保PCR反应的特异性。

（4）确定合理的延伸反应时间，综合考虑不同扩增片段的长度而定，延伸时间不宜过长，否则会导致非特异性扩增带的出现，
一般比单一PCR 扩增的延伸时间略长。

本实验的延伸时间从最初的3 min 减少到1 min，保证
了扩增条带的特异性。

最后，一般35 个循环的扩增量就可以较好地用于电泳实验的区分。

对育种材料和杂交后代中HMW-GS的准确、有效鉴定和选择则是小麦优质育种的关键。

传统SDS-PAGE鉴定方法存在一定的局限性，在鉴别分子量大小和迁移率十分接近的亚基时，比如
Ax2 和Ax2*亚基，即使延长电泳时间，二者也不容易区分，且凝胶制备和电泳分离时间较长[15]。

随着愈来愈多的小麦HMW-GS 基因被克隆，明确了相应基因序列的功能区，其等位基因
的特异分子标记也不断被开发出来[16-17]。

利用分子标记辅助选择可以加快优质亚基在同一品种中的聚合，但是单重PCR的鉴定成本相对较高，加之扩增反应体系的稳定性等原因，在中国
现阶段的小麦育种实践中，往往只有相对较少的育种者采用此项技术。

多重PCR是近年发展起
来的实用、可靠的分子标记辅助选择技术，国内外学者已先后开发了针对不同亚基组成性状的
多重PCR 体系[7-10,16-17]，其扩增体系、电泳条带不尽相同。

由于多重PCR反应体系可同时
鉴定不同亚基基因，因此，明显节省了成本，提高了分子鉴定的效率。

相信在以后的优质小麦
育种实践中，会有越来越多的育种者认识到多重PCR分子标记的优势并应用到自己的新品种选
育实践中。

本研究利用小麦高分子量谷蛋白亚基等位基因的特异标记，针对中国小麦优质Ax1/Ax2*和Dx5 亚基百分率较低的实际情况，建立起相应的二重AS-PCR 反应体系，扩增条带差异明显，
可以同时检测Ax1/Ax2*和Dx5 优质亚基，并利用已知HWM-GS 组成的品种（系）的SDS-PAGE
电泳实验加以验证，实验结果表明该分子标记鉴定结果和已知鉴定品种的亚基组成基因型一致。

该反应体系可靠、快速、准确，可用于小麦品质育种中亲本分类、种质资源评价和杂交后代优
质亚基基因聚合的标记辅助选择育种，将有助于加快优质小麦新品种选育进程。