临床分离志贺菌耐药性分析及1类整合子的检测

临床分离志贺菌耐药性分析及1类整合子的检测
潘亚超;刘艳艳;朱玉林;胡立芬;程君;叶英;李家斌
【摘要】目的了解2007年至2010年安徽省临床分离志贺菌耐药性和1类整合酶基因(int I1)、qacE△1-sul1基因及整合子携带的耐药基因盒的分布.方法琼脂稀释法检测21种抗菌药物对志贺菌的最低抑菌浓度.PCR扩增int I 1和qacE△1-
sul1基因,对阳性菌株可变区基因盒序列进行分析.结果 137株志贺菌对萘啶酸、氨苄西林、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药率均80.0％以上,且多重耐药率达94.2％,但对三代头孢菌素和氟喹诺酮类耐药率在33.0％以下.int I 1的检出率为89.1％(122/137),检出dfrA 17-aadA5和aar-3-aacA4两种基因盒,首次在志贺菌中检测到aar-3-aacA4基因,GenBank登录号JF271916.结论安徽省临床分离志贺菌多重耐药现象严重.临床仍可选用氟喹诺酮类和三代头孢菌素作为本地区细菌性痢疾的经验性治疗.1类整合子与志贺菌的耐药具有一定的相关性.%Objective To investigate the distribution of intll integrase gene, qacEAl-sull gene and gene cassettes embedded in shigella clinical isolates. Methods Antimicrobial susceptibility testing was performed by agar dilution method. The presence of class 1 integron and resistance genes was detected by polymerase chain reaction (PCR). The array of gene cassettes was determined by DNA sequencing. Results Antimicrobial susceptibility testing showed a high level of resistance to nalidixic acid (97.8%), ampicillin (93.4%), and co-trimoxazole (81.0%). Although high prevalence of multidrug resistance (94.2%) was identified, less than 33.0% of the Shigella isolates tested was resistance to fluoroquinolones and the third generation cephalosporins. Intll gene was detected in 122 (89.1%) isolates
and two types of class 1 integron structures were identified in this study. The identified gene cassettes within class 1 integron were as follows:
dfrA17-aadA5, which confer resistance to trimethoprim and streptomycin/ spectinomycin, respectively; aar-3-aacA4, which confer resistance to rifampin and aminoglycosides, respectively. The gene was submitted to the GenBank database, and the accession number was JF271916. Conclusions The situation of multidrug resistance in Shigella isolates is fairly serious, and the existence of class 1 integron plays an important part in drug resistance. Fluoroquinolones and the third generation cephalosporins still can be used in treating patients infected with Shigella as empirical therapy.【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2012(037)001
【总页数】5页(P68-72)
【关键词】志贺菌;耐药性;1类整合子
【作者】潘亚超;刘艳艳;朱玉林;胡立芬;程君;叶英;李家斌
【作者单位】安徽医科大学第一附属医院,合肥230022;安徽医科大学第一附属医院,合肥230022;安徽医科大学第一附属医院,合肥230022;安徽医科大学第一附属医院,合肥230022;安徽医科大学第一附属医院,合肥230022;安徽医科大学第一附属医院,合肥230022;安徽省细菌耐药监控中心,合肥230022;安徽省细菌耐药研究所,合肥230022;安徽医科大学第一附属医院,合肥230022;安徽省细菌耐药监控中心,合肥230022;安徽省细菌耐药研究所,合肥230022
【正文语种】中文
【中图分类】R378
细菌性痢疾是由志贺菌引起的具有高度传染性的胃肠道疾病。

近年来，由于抗菌药物在临床上和畜牧业中的大量应用，在抗菌药物选择性压力的作用下，志贺菌的耐药和多重耐药日趋严重。

整合子作为一种可移动基因元件，在细菌多重耐药的传播中起了重要作用。

为了掌握本地区临床分离志贺菌的耐药特征，以指导临床合理用药，对2007-2010年安徽省临床分离的137株志贺菌对21种抗菌药物的敏感性进行分析，并检测1类整合子及其携带的耐药基因盒，探讨志贺菌耐药与1类整
合子的相关性。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
安徽省细菌耐药中心收集2007年9月至2010年10月， 30多所医院临床分离
非重复志贺菌137株。

所有菌株均经全自动微生物分析仪(Microscan Walkaway-96 System,Siemens,Germany)自动鉴定系统鉴定。

质控菌株为大肠
埃希菌ATCC 25922，为本实验室保存。

1.1.2 抗菌药物
所用抗菌药物除萘啶酸为Sigma公司产品外，其余药物均购自中国药品生物制品
检定所。

所用药物为：氨苄西林，哌拉西林，三唑巴坦，头孢吡肟，头孢噻肟，头孢西丁，头孢他啶，头孢哌酮，头孢曲松，氨曲南，庆大霉素，阿米卡星，萘啶酸，诺氟沙星，环丙沙星，左氧氟沙星，加替沙星，四环素，氯霉素，甲氧苄啶，磺胺甲噁唑，亚胺培南。

1.1.3 主要试剂
引物由上海生工公司合成；ExTaqDNA聚合酶、dNTP、Taq buffer、loading buffer和DNA marker均购自大连宝生物公司，M-H琼脂购自英国Oxoid公司，琼脂糖购自美国Invitrogen公司。

1.1.4 主要仪器
DNA扩增仪(德国Biometra公司)；电泳仪(北京六一仪器厂DYY.10C型)；分析
天平(上海民桥精密科学仪器公司FAll04型)；凝胶成像分析系统(上海天能科技公司)。

1.2 方法
1.2.1 药敏试验
采用琼脂对倍稀释法检测21种抗菌药物对137株志贺菌的最低抑菌浓度(MIC)；MIC结果判定参照2009年CLSI公布标准[1]，并以大肠埃希菌ATCC 25922为
质控标准。

1.2.2 DNA模板的制备
采用煮沸法制备模板。

1.2.3 intⅠ1和qacE△1-sul1及相关耐药基因盒的检测和序列分析
引物：委托上海生工合成引物(见表1)；反应体系：PCR反应体系为25μL，包括Ex10×Buffer 2.5μL、dNTP 2μL(2.5mmol/L)、上下游引物各1μL(10μmol/L)、Ex Taq 0.125μL(0.625U)、DNA模板2μL (20～100ng)加去离子水至25μL；
intⅠ1和qacE△1- sul1的循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火
30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸5min；可变区的扩增参数：94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸10min；产物分析：反应结束后取PCR扩增产物5μL加
6×Loading buffer 1μL，在1.2%的琼脂糖凝胶(含1×TAE和EB)上120V电泳
40min，采用天能凝胶成像系统分析；测序：PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，所得测序结果在GenBank数据库中进行同源性比对。

1.2.4 统计学方法
采用SPSSl3.0统计分析软件进行统计学处理。

采用卡方检验进行统计学分析
(P<0.05为差异有统计学意义)。

2 结果
2.1 药敏试验结果
137株志贺菌对21种抗菌药物的耐药率见表2。

137株志贺菌对氨苄西林、萘啶酸、四环素、氯霉素及磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药率为76.6%～97.8%。

对氟喹诺酮类及头孢菌素类抗菌药物敏感性相对较高，耐药率均在33%以下，对亚胺培南100%敏感。

高达94.2%(129/137)的菌株表现出对三类或三类以上抗菌药物耐药，多重耐药严重。

2.2 intⅠ1基因和qacE△1-sul1基因的分布情况
所检测的137株志贺菌临床分离株中78株intⅠ1和qacE△1-sul1均阳性，44株仅intⅠ1阳性而qacE△1-sul1阴性，8株仅qacE△1-sul1阳性而intⅠ1阴性，提示这些菌株携带1类整合子。

intⅠ1和qacE△1-sul1阳性率分别为89.1% (122/137)，62.0%(85/137)(图1)。

2.3 1类整合子可变区耐药基因盒的检测及测序分析
对所有intⅠ1基因阳性的菌株进行可变区的PCR扩增，在78株intⅠ1和qacE△1-sul1均阳性的菌株中，18株扩增出两种不同大小的特异性条带，经测序证实其中16株携带的耐药基因盒为：dfrA17-aadA5基因，片段大小约1700bp 左右，介导对磺胺类和氨基糖苷类药物的耐药；另2株携带aar-3-aacA4基因，片段大小约1400bp左右，介导对利福平和氨基糖苷类的耐药(图1)。

表1 PCR扩增引物序列Tab.1 Oligonucleotide primer sequences used for
PCR ampli fi cation?
表2 137株志贺菌对21种抗菌药物的药敏结果Tab.2 Resistance to 21 antimicrobial agents against 137 Shigella isolates?
2.4 1类整合子与志贺菌耐药的相关性分析(见表3)
1类整合子可变区阳性组与阴性组对哌拉西林、头孢吡肟、头孢哌酮、氨曲南、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、加替沙星耐药率差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论
随着抗菌药物的广泛使用，志贺菌的耐药现象越来越普遍，多重耐药日趋严重。

我们的药敏结果显示，志贺菌对萘啶酸、氨苄西林、及磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药
率均在80.0%以上。

对氟喹诺酮类及头孢菌素类抗菌药物敏感性相对较高，耐药
率均在33.0%以下，提示临床仍可选用氟喹诺酮类和三代头孢菌素作为本地区细
菌性痢疾的经验性治疗。

但本次试验志贺菌对环丙沙星、头孢噻肟和头孢曲松的耐药率明显高于国内外报道[5-6]，应引起高度重视，加强耐药性检测，规范抗菌药
物的使用，防止耐药性的进一步扩散。

137株志贺菌中有7株同时对喹诺酮类和
第三代头孢菌素耐药，这7株中有5株对头孢吡肟、哌拉西林/三唑巴坦和亚胺培南均敏感，1株对头孢吡肟中介，对哌拉西林/三唑巴坦和亚胺培南均敏感，还有
1株仅对亚胺培南敏感，提示在使用喹诺酮类和第三代头孢菌素治疗失败的情况下尚可选用头孢吡肟、哌拉西林/三唑巴坦和亚胺培南等抗菌药物。

高达94.2%的菌株表现出对三类或三类以上抗菌药物耐药，多重耐药现象严重。

大多数的多重耐药菌都含有对氨苄西林，磺胺甲噁唑/甲氧苄啶，四环素，氯霉素，萘啶酸的耐药性，这可能与它们长期作为一线药物用于治疗腹泻和其它感染性疾病有关[7]，本次研
究与国内外报道相似[8-11]。

图1 1类整合子intⅠ1、可变区、qacE△1- sul1扩增电泳图Fig.1 Electrophoretogram of intⅠ1,variable region and qacE△1- sul11,18：DNA
Marker，2～5：第1类整合酶阳性菌株，6～7：aar-3-aacA4基因盒扩增片段，8～11：dfrA17-aadA5基因盒扩增片段，12～15：部分qacE△1-sul1阳性菌株，16：阴性对照，17：空白水对照。

整合子是细菌特别是革兰阴性细菌中，一种能够识别和俘获基因盒，并含有位点特异性重组表达系统的可移动性基因元件。

它可以通过存在于可接合性质粒、转座子、整合型噬菌体在同种和不同种菌属间传播耐药基因，并且1个整合子可俘获多个
基因盒，表达对不同抗菌药物的多重耐药性，使细菌的耐药性得以广泛播散。

其中1类整合子是临床分布最广泛的一类整合子，在临床检测中具有重要意义[12]。

国外在1类整合子与志贺菌耐药的相关性研究较多，而国内仅见于北京[13]、上海[14]、杭州[2]、济南[15]，郑州[8]，安徽地区尚无相关报道。

本实验对1类整合子的研究中发现，137株志贺菌临床分离株中有78株intⅠ1
和qacE△1- sul1均阳性，44株仅intⅠ1阳性而qacE△1- sul1阴性，8株仅qacE△1- sul1阳性而intⅠ1阴性，提示这些菌株含有不同的5'-CS和3'-CS，因
此仅以intⅠ1或qacE△1-sul1检测1类整合子，极有可能造成漏检。

而对所有
intⅠ1阳性的菌株进行可变区扩增，只有18(13.1%)株可变区阳性，推测其余
intⅠ1和qacE△1-sul1均阳性的菌株可能含有空整合子，intⅠ1阳性而qacE△1-sul1阴性菌株中可能含有非典型1类整合子即3’-CS被一段插入序列IS1所取代[2]或3'-CS不完整甚至缺失。

18株可变区扩增阳性菌中，16株携带dfrA17-aadA5耐药基因盒，介导对磺胺类和氨基糖苷类药物的耐药，与药敏结果相符。

另2株携带aar-3-aacA4耐药基因盒，介导对利福平和氨基糖苷类的耐药，而药
敏结果中仅其中1株对庆大霉素耐药，可能是由于耐药基因未表达。

在志贺菌中
检测到aar-3-aacA4基因尚属首次报道，递交GenBank获取登录号为JF271916。

对1类整合子与临床分离志贺菌耐药相关性分析发现，1类整合子可变区阳性组与阴性组对哌拉西林、头孢吡肟、头孢哌酮、氨曲南、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟
沙星、加替沙星耐药率差异具有统计学意义，对其余抗菌药物耐药率差异无统计学意义。

我们所检测到的基因盒仅能解释志贺菌对庆大霉素和阿米卡星的耐药性，推测志贺菌中还可能存在介导对β-内酰胺类抗菌药物耐药，但通过我们目前的检测方法尚未能检测到的某种非典型1类整合子[2]，且志贺菌中除了含有1类整合子外，可能还含有其他类型的整合子，或存在其他耐药机制，如产生灭活酶，药物作用靶位点的改变，外膜渗透性降低及主动外排机制等。

表3 1类整合子与志贺菌耐药相关性分析Tab.3 The analysis of the relationship between class 1 integron and antimicrobial resistance in Shigella?
目前，喹诺酮类、β-内酰胺类是临床上治疗菌痢的一线药物，而志贺菌对这些抗菌药物产生的耐药性使得菌痢的治疗越来越困难。

今后，将对志贺菌中非典型1类整合子及其他类型整合子进行检测并分析其与耐药的相关性，进一步深入研究志贺菌的其他耐药机制，为监控耐药菌株的流行趋势和临床合理应用抗菌药物提供科学依据。

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