PCR发展历程综述

PCR技术发展历程综述
摘要：PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下。

以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点。

通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

本文简要叙述了PCR技术的发展历程及现在所发展起来的相关技术。

关键词：PCR技术变性退火延伸
1.PCR技术的发展简史
1971年Khorana等最早提出PCR理论：“DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA基因”。

因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA 限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana等的早期设想被忽视。

1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶工Klenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功，1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人；1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者。

但当时Mullis所使用的大肠杆菌聚合酶1的片段Klenow存在一些缺陷：Klenow酶不耐热，在对DNA模板进行热变性时，会导致此酶的钝化，因此需要每完成一个扩增周期增加一次酶。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，提高扩增DNA片段的均一性，1988年Saiki等从温泉中分离的一种水生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序，最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。

现已被广泛应用于农学、植物病理学、生物学等领域的研究。

最初的PCR技术相当不成熟,但在随后的几十年里，PCR技术被不断改进，它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片断。

短短几十年，该技术已经成为最常用也最重要的分子生物学技术之一，其应用范围从基本的基因扩增，扩展到基因克隆、基因改造、传染病源分析、遗传指纹鉴定等，甚至扩展到许多非生物领域。

2.PCR技术的原理
PCR 技术是根据待扩增的已知DNA 片段序列，人工合成与该DNA 2 条链末端互补的 2 段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA 序列（模板）在酶促作用下进行扩增。

PCR 的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的 3 个步骤：第1 步是高温条件下的DNA 模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链；第 2 步是退火，即人工合成的 2 个寡核苷酸引物与模板DNA 链3’端经降温至55 ℃退火；第3 步是延伸，即在4 种dNTP 底物同时存在的情况下，借助TaqDNA 聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链。

经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA 模板继续反应，由此循环进行。

循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30 次，DNA 可扩增l00 万~200 万倍。

PCR 反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。

因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。

3.PCR技术进步关键
3.1热循环仪
市场上有众多的产品, 在质量和技术上首推PE及MJ reasearch。

总的发展趋势是1) 无油操作, 要求的反应体积小, PE 2400 可做小至5uL 的反应; 2) 升降温速度快, PE9700 可达到 3.5℃/ s, 温控精度及静态样品温度均衡性高,这一点是通过控制反应管内的温度,而非加热块的温度来实现的; 3) 界面友好,操作灵活,显示直观,允许多用户。

此外, 还有几种特殊用途的PCR 仪: 大容量PCR 仪, The Tetrad( MJResearch) 可同时做1536 个反应, 适合于高通量实验室的要求; 实时定量PCR, ABI PRISM TM5700( PE) 能对PCR 过程做到实时定量监控,闭管操作,无污染,无须扩增后处理;梯度PCR 仪, 例如, Eppendorf 的产品,可在一个反应槽内,一次实验当中快速地测定最佳变性温度和退火温度, 节省时间, 减轻实验强度;PCR 仪的加热部分和控制部分分离, Remote Alpha Dock TM System( RAD MJ Research) 的这两部分可以分开远达3m 节省实验室空间, 便于进行自动化操作。

同时有多种形式的加热部分可供选择,可以满足不同的要求。

3.2引物设计与合成
引物的设计可通过计算机和网络来实现。

网上有许多提供免费在线引物设计服务的网址和软件，例如在线版的Primer3.0，以及Primer5.0等软件，设计好的引物则完全由专业公司来合成, 合成的引物一般进行PAGE 纯化,而且可以根据实验的要求对引物采取不同的修饰处理。

3.3DNA聚合酶系
已经发展出了多种具有各种不同特性的聚合酶和酶反应体系( 表1) 。

结合优化的缓冲液条件,DNA 聚合酶已具有更高的特异性,敏感性,可以扩增出更长的产物,并且可成功地用于富含GC 的模板的扩增。

目前已开发出了一系列可满足不同需求的DNA 聚合酶试剂盒,简化了PCR 操作,提高了实验的重现性。

4.PCR相关技术
4.1常规RT-PCR技术
由于目前常利用cDNA来研究基因的功能,而cDNA是由mRNA反转录而成。

所以采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)可扩增大量cDNA。

主要包括两个步骤,一个是反转录,另一个就是PCR,首先提取RNA并纯化,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA第一链。

然后以第一链cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。

反应过程的第一步是从细胞中提RNA,并分离出mRNA。

第二步以mRNA 为模板,在反转录酶的催化下合成cDNA。

第三步以cDNA为模板,用PCR对靶序列进行扩增。

最后用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

4.2多重PCR（mutiplex PCR）技术
PCR 技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR 管内的多个模板反应，在一个PCR 管中同时检测多个目标DNA 分子。

多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段。

在同一反应体系中，多重PCR 技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。

一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR 的扩增效果。

主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR 缓冲液成分、dNTP 的用量、引物及模板的量等。

另一方面，DNA 的抽提质量也影响多重PCR 扩增效率，如DNA 抽提不干净或降解都将影响PCR 扩增效果。

4.3反向PCR技术
反向PCR(reverse PCR)，又称为染色体缓移(chrornosme walking)，它是指利用在已知序列内部没有切点的限制性内切酶对此段DNA进行酶切，在DNA连接酶作用下自连形成环状DNA分子，然后利用方向合适并与已知序列两端互补的引物，以连接成环的DNA为模板，经PCR扩增．得到已知序列的旁侧DNA 片段。

与常规PCR技术相比。

反向PCR优势突出，但它需要从许多酶中选择限制酶。

或者说必须选择一种合适的酶进行酶切。

另外，由于大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，在YAC或Cosmid的未知功能序列中有时也会存在这些序列。

从而导致反向PCR得到的探针与多个基因序列杂交，影响扩增效果。

4.4巢式PCR(嵌套PCR)技术
这是一种对PCR的优化模式,不受平台效应的限制,而且比单一的一对引物PCR扩增灵敏度特异性高1000倍。

由两轮PCR扩增和利用两对引物组成,其中第二对引物是在第一对引物的内部,第一轮PCR的产物作为第二轮PCR的模板,增强了产物的特异性。

反应过程的第一步是引物的设计,原则与常规PCR相同,只不过是设计两对嵌套式引物。

第二步所用的模板通常都是反转录而来的cDNA,经过两次PCR。

第三步检测PCR反应产物。

此反应大多应用在当模板DNA较少时,用一次PCR难以得到满意的结果,用巢式PCR能得到很好的效果。

4.5实时荧光定量PCR 技术
1996 年，学者经过研究，在传统PCR 技术的基础上，首创了实时荧光定
量PCR 技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。

实时荧光定量PCR 技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR 技术研究史上从定性到定量的飞跃。

荧光定量PCR 技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR 反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

实时监测这一特点是常规PCR 技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。

常规PCR 技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR 技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断。

一个PCR 循环反应结束之后，定量PCR 仪可以收集 1 个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到 1 条荧光扩增曲线。

荧光信号在指数扩增阶段，PCR 产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析。

另外还有多种PCR相关的技术,如不对称PCR,MSP甲基化特异PCR,免疫PCR,锚定PCR,PACE-cDNA末端的快速扩增……可根据研究目的不同作相应的选择。

5.展望
PCR作为一项“革命性的技术”，不仅推动了遗传与分子生物学的发展．而且，在其它领域科学家的努力与创新下。

其不断与该领域的核心技术相结合，极大地推动了此领域的发展。

传统PCR 技术以及衍生出来的新型PCR 技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。

随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR 技术将会逐渐完善并广泛应用。

多重PCR 技术在食品病原微生物、非致病微生物及环微生物检测中具有重要作用；未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，总之，随着科学技术的不断进步．PCR技术必将得到新的发展，以之为基础的新技术将不断出现。

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