光合细菌产氢过程中氮源利用实验

从表 1 可以看出，铵盐和硝酸盐条件下，光合细 菌的生长情况明显好于其他氮源，以铵盐作为氮源 时，光合细菌的生长情况最为良好，培养 120 h 后， 菌体 OD 值达到 3. 71。这是因为生物对氮源的利用 形式为 NH4+ ，铵盐不需进行转换就可以直接为光合 细菌所利用，而硝酸盐、谷氨酸等氮源，菌体不能直 接利用，需要转化为 NH4+ ，才能为细胞所利用，所以 铵盐类物质为光合细菌的最佳生长氮源。相对于其 他氮源，光合细菌在 N2 条件下生长最为缓慢，这是 因为光合细菌的固氮效率要比生长速率慢得多，氮 源的缺乏导致生长速率较慢。
图 1 不同氮源浓度对光合细菌生长的影响 Fig． 1 Effect of nitrogen concentration on hydrogen production
图 1 表明，氨氮的添加浓度对光合细菌的生长 有很大影响，（ NH4 ） 2 SO4 浓度为 0 mmol / L 时，菌体 几乎没有出现生长现象，说明氮源是光合细菌生长 的必须物 质，氮 源 的 缺 乏 会 引 起 菌 体 生 长 的 停 止， （ NH4 ） 2 SO4 浓度为 0 mmol / L 时菌体出现少量的生 长，可能是由于接种时带入少量的（ NH4 ） 2 SO4 所引 起的； （ NH4 ） 2 SO4 浓度为 0 ～ 10. 5 mmol / L 时，在菌 体生长初期，菌体生长随着氮源浓度的升高而升高， 但当菌体进入对数生长期时，10. 5 mmol / L 的浓度 对菌体的生长产生较强的抑制作用，表现为菌体培 养 48 h 后生长放慢，生长速率下降； （ NH4 ） 2 SO4 浓 度为 3. 5 ～ 7 mmol / L 时，菌体生长情况较为良好，氮 源添加 浓 度 为 7 mmol / L 时，菌 体 生 长 最 为 良 好。 （ NH4 ） 2 SO4 添加浓度超过 10. 5 mmol / L 时，氨氮浓 度对菌体的生长产生较强的抑制作用，菌体几乎没 有出现生长，氨氮对细胞的抑制作用主要是由于过
样量 500 μL，保留时间 2 min。产氢总量为 168 h 产 氢量［21］。
（ 6） NH4+ 的测定
离心样品，收 集 上 清 液，在 室 温 下 添 加 NaOH
后，插入 P-NH321 型电极，搅拌 5 min 后读数。从标 准曲线上查找相应 NH4+ 的浓度。
3 结果与分析
3. 1 光合细菌生长过程中对氮源的利用 光合细菌是一类古老的固氮菌类，可利用广泛
除去后于干燥箱 105℃ 干燥 2 h，冷却后称 m2 ，细胞 干质量为
mCDW
= m2 － m1 30
（ 3） 菌液 pH 值测定
培养液 pH 值 采 用 瑞 士 Delta320 型 酸 度 计 测
定，广州德润仪器科技有限公司生产，pH 值测量范
围 0 ～ 14，分辨率 0. 01。
（ 4） 光照强度测定
摘要： 对从活性污泥中筛选出的光合产氢混合菌群进行了光合产氢实验，研究了氮源对光合细菌生长和产氢过程 的影响，分析了光合产氢过程中混合菌群对氮源的利用规律。结果表明： 光合细菌生长过程中对氮源有很强的选 择性，无机氮源尤其是铵盐类物质最易为光合细菌所利用，有机氮源次之； 以 （ NH4 ） 2 SO4 为氮源，添加浓度 为 7 mmol / L时，菌体生长最为良好，在培养 24 ～ 48 h 内，（ NH4 ） 2 SO4 利用速率最大，最大消耗速率为 0. 105 mmol / L。 不同种类氮源对光合 产 氢 混 合 菌 群 产 氢 的 影 响 不 很 明 显 ，利 用 有 机 氮 源 产 氢 效 果 好 于 无 机 氮 源。 光 合 细 菌 以 （ NH4 ） 2 SO4 为氮源，添加浓度为 3. 5 mmoh 内有 少量消耗，菌体进入产氢高峰期后不再利用氮源。 关键词： 光合细菌 混合菌群 光合产氢 氮源 实验 中图分类号： TK6 文献标识码： A 文章编号： 1000-1298（ 2014） 10-0194-06
等光合细菌纯菌种的产氢研究，关于氮源对光合产
氢混合菌群生长和产氢的影响以及混合菌群产氢过 程中氮源的利用还未见相关报道。本文研究氮源对 光合产氢混合菌群生长和产氢的影响以及光合细菌 产氢过程中氮源的代谢规律，以期初步揭示光合细 菌产氢过程中氮源的利用规律，为光合细菌产氢过 程中氮代谢的机理研究提供相关依据。
表 1 不同氮源对光合细菌生长的影响 Tab． 1 Effect of different nitrogen source on
growth of photo-bacteria
氮源 OD 值
氮气 0. 63
硝酸钠 硫酸铵 蛋白胨 谷氨酰胺
1. 94
3. 71
2. 72
2. 84
196
农业机械学报
2014年
收稿日期： 2013-10-14 修回日期： 2013-11-28 * 国家自然科学基金资助项目（ 50976029） 、国家高技术研究发展计划（ 863 计划） 资助项目（ 2012AA051502） 和高等学校博士学科点专项
科研基金资助项目（ 20060466001） 作者简介： 王毅，实验师，主要从事可再生能源研究，E-mail： wangyi2543@ 126． com 通讯作者： 张全国，教授，博士生导师，主要从事可再生能源研究，E-mail： zquanguo@ 163． com
氮源进行生长，既能利用无机氮源也可利用有机氮 源，也可以通过固氮作用，将空气中的氮气固定进行 生长，但光合细菌对不同类型的氮源的利用效率有 很大不同，不同菌种对同一氮源的利用也有很大不同， 光合细菌生长过程中对氮源有很强的选择性［22］。 3. 1. 1 不同氮源对光合细菌生长的影响
选取氮气、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酰胺、蛋白胨几 种物质作为氮源，考察不同氮源对光合细菌生长的 影响，结果如表 1 所示。
采用广州骏凯电子科技有限公司生产的 TES-
1335 型数字式照度计测定，分辨率为 0. 01 lx。
（ 5） 氢气含量测定
氢气含量测定采用 GC-14B 型气相色谱仪，色
谱柱填料为 5A 分子筛，氮气作载气，流量 45 mL / min，
采用 99. 999% 的高纯氢气作标准气。色谱条件： 进
样口温度 100℃ ，柱温 80℃ ，TCD 检测器 150℃ ，进
引言
氢能由于其清洁、高效、可再生的特点，是一种 最为理想的替代能源［1 － 2］。利用光合细菌制氢，反 应条件温和，能够利用工农业有机废水制氢，能将太 阳能利用、氢能开发和有机废水净化处理相结合，是 一种非常理想的低成本、低能耗的制氢方法［3 － 5］。
光合细菌产氢主要是由固氮酶催化，氮源的种 类及其浓度对光合细菌产氢有很大的影响。氮源对 光合细菌产氢的影响主要体现在高浓度的氮源对产 氢有较强的抑制作用，主要是由于高浓度的 NH4+ 对 光合细菌的固氮酶的合成有较强的抑制作用，固氮 酶缺失使得光合细菌的产氢受到严重抑制［6 － 8］。此 外，NH4+ 对光合磷酸化也有解偶联作用，影响光合 细菌通过光合作用产生 ATP，光合产氢过程中过量 的 NH4+ 直接导致细胞内 ATP 水平的下降，光合产 氢过程因能量缺失而使产氢受到抑制［9］。NH4+ 对 固氮酶的抑制作用是可逆的，当 NH4+ 消耗完毕之 后，固氮酶 的 活 性 就 可 以 恢 复，光 合 细 菌 则 恢 复 产 氢［10］。国内外在固氮 酶 放 氢 机 理 及 固 氮 酶 活 性 影 响因素方面已有一定的了解［11 － 16］。氮源对光合细 菌 产 氢 的 影 响 研 究 多 集 中 于 Ｒs． Ｒubrum、 Ｒhodopseudomonas capsulata、Ｒhodobacter sphaeroides
1 材料与方法
1. 1 实验材料 1. 1. 1 实验菌种
采用河南农业大学农业部可再生能源新材料与 装备重点实验室筛选培养的高效光合产氢菌群作为 实验菌株。从郑州东郊新大牧业种猪场、郑州市污 水处理厂、郑州市西刘湖、郑州市郊豆腐加工厂、河 南农科院实验田、郑州市金水河等地在 4 个季节取 得 24 个样品菌株，经过富集、分离培养，筛选出来的 高效产氢优势菌种 F1、F5、F7、F11、L6、S7 和 S9 组 成光合产氢混合菌种群［17］。 1. 1. 2 培养基
总体上看，光合细菌生长过程中对氮源有很强 的选择性，无机氮源最有利于光合细菌的生长，尤其 是铵盐类物质最易为光合细菌所利用，有机氮源次 之，N2 条件下菌体生长则最为缓慢。 3. 1. 2 不同铵盐浓度对光合细菌生长的影响
以（ NH4 ） 2 SO4 为唯一氮源，设 0、3. 5、7、10. 5、 14 mmol / L 5 个浓度，研究不同氮源浓度对光合细菌 生长的影响，如图 1 所示。
2 0 1 4 年 10 月
农业机械学报
doi： 10． 6041 / j． issn． 1000-1298． 2014． 10． 030
第 45 卷 第 10 期
光合细菌产氢过程中氮源利用实验*
王 毅 周雪花 张志萍 张全国
（ 河南农业大学农业部可再生能源新材料与装备重点实验室，郑州 450002）
（ 1） 生长培养基（ GM） 在本研究 中，混 合 菌 群 生 长 所 用 培 养 基 配 方： NH4 Cl 0. 1 g， NaHCO3 0. 2 g，K2 HPO4 0. 02 g， CH3 COONa 0. 3 g，MgSO4·7H2 O 0. 02 g，NaCl 0. 2 g，酵 母膏 0. 1 g，蒸馏水 96 mL，微量元素溶液 1 mL，生长因
点记录培养液在波长 660 nm 处的吸光度（ OD 值） 。 ［20］
（ 2） 细胞干质量测定
取 50 mL 洁净离心管置鼓风干燥箱于 105℃ 干
燥 1 h，冷却后称取质量 m1 ； 加入样品 10 mL 后以 5 000 r / min 离心 10 min，弃去上清液后再加入去离
子水 20 mL 继续离心 10 min，离心完成后将上清液
第 10 期
王毅 等： 光合细菌产氢过程中氮源利用实验
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子溶 液 1 mL，pH 值 为 7. 0。 其 中，生 长 碳 源 为 3. 0 g / L CH3COONa，微 量 元 素 溶 液 为 FeCl3·6H2O 5 mg、CuSO4·6H2 O 0. 05 mg、MnCl2·4H2 O 0. 05 mg、 ZnSO4·7H2 O 1 mg、H3 BO4 1 mg、CO （ NO3 ） ·6H2 O 0. 5 mg，溶解到 1 000 mL 蒸馏水中，生长因子溶液为 维生素 B1 0. 01 mg、尼克酸 1 mg、生物素 0. 01 mg、对氨 基苯甲酸 0. 1 mg，溶解到 100 mL 蒸馏水中［18］。
（ 2） 产氢培养基（ HM） 产氢培养基用谷氨酸钠代替基础培养基中的 （ NH4 ） 2 SO4 ，其他成分与基础培养基相同［19］。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 生长实验 培养容器采用 500 mL 玻璃瓶，接种对数期种子 液（ 菌体培养 40 h） ，接种量为 20% 。接种后用反口 橡胶塞密封，用一个长针头插入液面下方取样。光 照厌氧培养在 30℃ ，3 000 lx 条件下进行。实验周 期为 7 d。 （ 1） 不同氮源对光合细菌生长的影响 选取等量 N2 、（ NH4 ） 2 SO4 、谷氨 酰 胺、蛋 白 胨、 谷氨酸作为氮源，考察不同氮源对光合细菌生长的 影响。 （ 2） 不同铵盐浓度对光合细菌生长的影响 以（ NH4 ） 2 SO4 为 唯 一 氮 源，分 别 设 0、3. 5、7、 10. 5、14 mmol / L 5 个浓度，研究不同铵盐浓度对光 合细菌生长的影响。 1. 2. 2 产氢实验 培养容器采用 500 mL 玻璃瓶，接种对数期种子 液（ 菌体培养 40 h） ，接种量为 20% 。接种后用反口 橡胶塞密封，用一个长针头插入液面下方取样，另外 一个针头插入培养瓶上部气体空间用以收集产生的 气体，气体使用排水集气法收集，定时记录产氢量。 光照厌氧培养在 30℃ ，3 000 lx 条件下进行。实验 周期为 7 d。 （ 1） 不同氮源对光合细菌产氢的影响 选取等量 （ NH4 ） 2 SO4 、NaNO3 、谷氨酰胺、蛋白 胨、谷氨酸作为氮源，考察不同氮源对光合细菌产氢 的影响。 （ 2） 不同铵盐浓度对光合细菌产氢的影响 以（ NH4 ） 2 SO4 为唯一氮源，设 0、3. 5、7、10. 5、 14 mmol / L 5 个浓度，研究不同氮源浓度对光合细菌 产氢的影响。 1. 2. 3 检测方法 （ 1） OD 值的测定 收集对数期培养物，经离心洗涤后悬浮于 60% 的蔗糖溶液中，于 HP8453 型分光光度计上扫描，扫 描范围为波长 190 ～ 900 nm，获得细胞的吸收光谱，定