沉淀反应与凝集反应yhl

二、间接血凝试验
Patient
1 2 3 4 5 6 7 8
反向间接血凝试验
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Pos. Neg.
Titer
64 8
512 <2 32 128 32
4
血凝试验强度
三、胶乳凝集试验
孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCG）含量明显增高。 反之，非孕妇尿中HCG含量甚微，不能消耗掉抗HCG抗体。
第一节 凝集反应的特点
一．凝集反应定义
细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等颗粒性抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结 合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在下，形成 肉眼可见的凝集现象。参与凝集反应的抗体有IgM和IgG,IgM的凝集作用比IgG大数百倍。
01
1. 玻片凝集试验 2. 试管凝集试验
（一）玻片凝集试验
01 Y
02 +
方法评价:
定性试验，简便和快 速；敏感度低。
临床应用:
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菌种鉴定；血清学分
型；血型鉴定。
Y
03
04 Y
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—
—
+
+
+
—
二、免疫浊 度测定
一．原理
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时， 在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复 合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对 浊度进行测定从而检测抗原含量。
2.影响因素
一．抗原抗体的比例：
反应体系中保持抗体过量
2. 抗体的质量:
特异性强，效价高，亲和力强。
二）技术要点：
三）影响因素
制备琼脂板，打孔，加样于孔内， 电泳2～3mA/cm ，0.5～1h 后，槽内加入相应抗血清作双向 扩散。
抗原抗体比例不当,需测抗原抗体 最适比;
抗血清的抗体谱，混合抗血清的 使用;
电泳条件直接影响分辨率。
四）应用
纯化抗原和抗体成分的分析及正 常和异常免疫球蛋的识别与鉴定
02
03
二、反应阶段
抗原抗体的特异性结合 出现肉眼可见的凝集现
象
三、特点
该方法简便、敏感度高， 应用广泛。
四、类型
按抗原的性质和反应方 式的不同分为：
直接凝集和间接凝集
第二节 直接凝 集反应
直接凝集反应(direct agglutination)：
颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作 用下，出现肉眼可见的凝集现象。
间接凝集反应的类型
一．正向间接凝集试验 二．反向间接凝集试验 三．间接凝集抑制试验 四．协同凝集试验
正向间接凝集 试验
用抗原致敏载体-检测抗体
2.反向间接 凝集试验
用抗体致敏载体---检测抗原
用抗原致敏载体--检测抗原
间接凝集抑制试验
4.协同凝集试验
协同凝集反应与间接凝集反应的原理相类似，但所用载体既非 天然的红细胞，也非人工合成的聚合物颗粒，而是一种金黄色 葡萄球菌。它的菌体细胞壁中含有A蛋白SPA具有与IgG的Fc段 结合的特性，因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗 体致敏的颗粒载体。如与相应抗原接触，即出现反向间接凝集 反应。协同凝集反应也适用于细菌的直接检测。
将待检血清或抗原和 致敏乳胶各滴一滴在 玻片上，阳性者5～ 10min即出现凝集。 如妊娠免疫诊：
明胶凝集试验
将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明胶颗粒上， 当致敏颗粒与样品血清作用时，若血清含有抗病 毒抗体则可形成肉眼可见的粉红色凝集。
五、间接凝集反应的应用
一）抗原的检测
反向间接凝集试验可用于检测病原体的可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。
平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂 糖薄层，凝固后打孔，孔径为 3mm，孔间距在3～5 mm之间， 在相对的孔中加入抗原或抗体， 放置湿盒37℃18～24h 后，观察 孔周围是否出现沉淀环。
应用
一．抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估 计；
二．抗原或抗体相对分子量的估计; 三．抗原性质的分析; 四．抗体效价的滴定; 五．抗原或抗体纯度的鉴定。
最适比例方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照

1/5
+
++ +++ +++ ++
+
±
—
1/10
+
++ ++ ++ +++ ++
+
—
1/20
+
++ ++ ++ +++ ++
+
—
1/40
—
±
+
+
++ +++ ++
—
1/80
—
—
全抗体检查。
第二部分 沉 淀 反 应
第一节 沉淀反应的特点
○ 第二节 液体内沉淀试验 ○ 第三节 凝胶内沉淀试验 ○ 第四节 免疫电泳技术
第一节 沉淀反应原理及特点
沉淀反应（precipitation）: 是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下 发生特异性结合而出现的沉淀现象,其特性 与经典的抗原抗体反应相同。
对流免疫 电泳
抗体球蛋白
带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动 蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向 正极移动
通电
＋
对流免疫电泳
结果分析：
无沉淀线出现则表明无相应 的抗原。
沉淀线位于抗原抗体孔中间， 说明两者比例较适合。
沉淀线偏向抗原孔一方，表 示抗体浓度＞抗原，反之， 则是抗体浓度＜抗原浓度。
2.沉淀反应
分两个阶段
01
02
第一阶段：
抗原抗体特异性结合，快速但不可见。
第二阶段：
形成肉眼可见的大的免疫复合物。
3.沉淀反 应的类型
①液体 内沉淀
试验
单向扩散试验 双向扩散试验
③凝胶 免疫电 泳技术
免疫浊度测定 絮状沉淀试验
②凝胶 内沉淀
试验
对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫电泳 免疫固定电泳
第十章 沉淀反应与凝集 反应
第一部分 凝集反应 第二部分 沉淀反应
汇报人姓名
第一部分 凝集反应
01 第一节 凝集反应的特点 Add a title
03 第三节 间接凝集反应 Add a title
05 第五节 抗球蛋白试验 Add a title
02 第二节 直接凝集反应 Add a title
04 第四节 自身红细胞凝集试验 Add a title
试管凝集试验
根据凝集程度记录为： ＋＋＋＋（100％凝 集）、＋＋＋（75％ 凝集）、＋＋（50％ 凝集）、＋（25％凝 集）。以出现50％凝 集以上的血清最大稀 释度为该血清的凝集 效价。
第三节 间接凝集 反应
间接凝集反应(indirect agglutination):
将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面， 然后与相应的抗体或抗原反应，在电解质的 作用下，出现肉眼可见的凝集现象。
二、火箭免疫电泳
1.原理：
电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原 量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物 形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀 峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。 单向免疫扩散＋电泳，定量检测技术
技术要点：
沉淀环
抗原
抗体+琼脂
上排为5个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排右2为异常病理 血清
影响因素： 抗体质量 标准曲线 ，质控血清 结果与真实含量不符 双环现象（不同扩散率抗
原性相同的两个组分）
2、双向扩散试验 （平板法）
原理：
技术要点：
将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的 对应孔中，两者在凝胶中自由扩散， 在比例合适处形成白色沉淀线。鉴 定抗原抗体的最基本、最常见的方 法之一
一、絮状沉淀试验
第二节 液体内沉
淀试验
絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体 混合，在电解质存在的条件下，抗 原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉 淀物。
方法受抗原抗体比例的影响非常明 显
应用于测定抗原抗体反应的最适比 例
三种类型： 1. 抗原稀释法：抗原最适比例 2. 抗体稀释法：抗体最适比例 3. 方阵滴定法：抗原抗体最适比例
思考题
什么是沉淀反应？ 沉淀反应的特点？ 单向扩散试验的原理和应用？ 什么叫直接凝集反应，什么叫间接
凝集反应？它们之间有何异同？ 叙述间接血凝试验的原理。
第四节 免疫电泳技术
优点：
一．加快反应的速 度。
二．提高了灵敏度。 三．增加了分辨率。
抗原抗体反应
的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量 电泳分析 ＋ 沉淀反应
一、对流免疫电泳
原理：双向扩散 + 电泳 比双向扩散试验灵敏度提
高8∼16倍
技术要点：制备1.2%巴比妥 琼脂凝胶板，在其上成对打 孔，孔径3mm，孔距6 mm， 于阴极侧孔内加待测血清， 阳性侧孔加抗血清，电泳。
单价抗体只能与一方抗原的抗原决定簇结合，不产生凝集反应， 当加入抗球蛋白抗体后，可以将两个各连接一方抗原决定簇的单 价抗体连接起来，出现凝集现象。
（二）间接Coombs试验
检测血清中的抗红 细胞抗体
临床应用：
在输血上的应用； 血型抗原抗体的检查； 对新生儿溶血性贫血性疾
病的诊断； 对溶血性贫血的研究； 对细菌或立克次体的不完
2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔， 孔内加待测样品，样品孔放负极侧， 6h后观察琼脂板上沉淀峰， 绘制标准曲线，求出待测样品浓度。
影响因素：
○ 琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则; ○ 电泳终点时间的确定;
标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形; ○ IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），抵消了电渗作用。
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（二）试管凝集试验
应用：
测定相应抗体的效价；可作临床诊断或流行病学调查。 在试管内颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。
方法评价：
半定量试验；简便、快速；敏感度低；可有假阳性。
二）抗体的检测
检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体。
第四节 自身红细胞凝集试验
未经致敏的受检者新鲜红细胞 试剂：抗人O型红细胞的单克隆抗体 临床应用：HIV检测、HBV检测
自身红细胞 凝集试验
第五节 抗球蛋白试验
抗球蛋白试验又称 Coombs试验
（一）直接 Coombs试 验
检测红细胞上抗体或不完全抗体
火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗 原；⑤⑥为标本
+
三、免疫电泳
一）原理：
区带电泳＋双向扩散。
1. 蛋白质抗原在电场中，由于迁移率（取决于其分子量的大小和所带净电荷的多少）不同，其泳 动速度不同，将复合蛋白质在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带。
2. 沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散 。
02 技 术 要 点 ：
将抗体混入0.9%琼脂糖内（50℃），未凝固前 倾注成平板，凝固后打孔（直径3～5mm ），孔 中加入抗原溶液和不同浓度的标准品，置湿盒内 37℃,24～48h 观察孔周围是否出现沉淀环。
单向扩散试验 （平板法）
单向扩散试验（平板法）
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环
3. 抗原抗体反应液的最适PH:
为6.5～8.5
第三节 凝胶内沉淀试验
一、原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇 并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。
二、方法
01 原 理 ：
抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形 成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。可 以定量。