基因工程的主要技术原理

①无带,先降,再稳定扩增
②有带,先高温稳定扩增,再降
（4）长片段PCR (long-range PCR)
①引物设计
25-30bp Tm相差不超过1℃
②扩增参数
缩短热变性时间， 94℃ 2 min 尽可能使升温、降温过程缩短 适当增加延伸时间，可到20min 二步法扩增
94℃ 2 min (预变性) 72℃ 7 min
template template
AD
3’ 5’
P1, P2, P3为特异性引物，25bp, Tm 65℃ 左右 AD为简并引物， 15-16bp, Tm 44-45℃
Liu, YG and Whittier RF (1995). Genomics 25:674-681.
五 .分子杂交 技术
1、Southern blot
4.8 kb
6.4 kb
ab
Pi36-1
Pi36-2
c
RiceGAAS预测
NBS-LRR
NBS-LRR
Northern blot的原理与Southern blot相比 有三点不同:
(1)检测的对象不同. (2) 变性方法是不同的, 它不能用碱变性,因为
碱变性会导致RNA的降解. (3)探针不同.
3、 Western blot
（3）降落PCR
配制的体系不变, PCR扩增的程序设置
上变化:
94℃ 4 min,
退火温度60℃
94℃ 30 sec,
66℃ 30 sec, 每2个循环降1-2 ℃, 20 cycles,
72℃ 2 min,
94℃ 30 sec,
56℃ 30 sec, 15 cycles,
72℃ 2 min
72℃ 7 min
⑥ RNase A 降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。
⑦ TE缓冲液 DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。
Tris-HCl维持溶液中pH值相对稳定；
EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。
⑧ 酚-氯仿
选用
蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋 白质，使蛋白质沉淀。
94℃ 30 sec, 65℃ 17 min 35个循环
（4）长片段PCR (long-range PCR)
③ 反应体系 选用扩增长片段的Taq酶 选用扩增高GC含量的 PCR buffer
④ 结合热启动和降落PCR进行
（5）不对称PCR 用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。
①引物浓度： 两个引物的浓度相差100倍。
当K+取代Na+时,这些复合物会从溶液中沉淀下 来，附在细胞碎片上一起被离心除去。
（2） 所用的试剂作用
① 葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA受机械力（震荡）的作用而降解。
② EDTA
Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的 活性，防止DNA被酶降解。
③ NaOH-SDS
NaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件， 使DNA双链变性。
③引物的特异性
引物应与核苷酸序列数据库的其 他序列无明显同源性。
④引物的碱基序列
3‘端（特别是最末及倒数三个碱基）必须与 模板严格配对，5’端可以不配对。
primer
3’GCTAGCTACTTAAG5’ 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’
template
5’端根据需要可设计成某个内切酶的切 点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位 点或生物素标记等，方便与以后操作。
⑤引物的碱基组成
1）尽可能提高G+C含量，以提高引物与模 板的结合力, G+C含量以 45%-65%为宜。
2）避免连续4个以上相同碱基排列或内部回文 序列. 5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’
发卡结构
T
CTGCCAGTCTAC3’ GACGG5’
3）避免形成引物二聚体（dimer） 两个引物之间不能有两个以上的连续 碱基序列互补。
适当提高复性温度可以提高引物与模板结 合的特异性，减少非特异产物的出现。
三、增加PCR特异性的措施
（1）引物设计 （2）引物的退火温度 （3）循环次数 （4）Taq DNA聚合酶，利用高保真DNA聚合酶 （5）降落PCR （6）热启动PCR （7）巢式PCR
四. PCR技术的扩展
（1）巢式PCR (nest PCR)
第二章 基因工程的主要技术原理
一、质粒DNA的提取
1 .碱裂解法提取质粒DNA （1）原理
DNA双链
变性 强碱
DNA单链 中性
复性
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快；
染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双 链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白 质—SDS复合物结合在一起;当K+取代Na+时,生成 不溶的PDS, 这些复合物从溶液中沉淀下来。
13
42
（2）热启动PCR (hot start PCR)
94℃ 4 min (预变性) 72℃ 7 min
94℃ 30 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 2 min 35个循环
ddH2O 10 x Buffer
25 mmol/L MgCl2 10 mmol/L dNTP 10 µM上游引物 10 µM下游引物 DNA模板 DNA Taq聚合酶
第五步：纯化DNA 上清液过柱或酚-氯仿抽提。
第六步：沉淀DNA 0.6倍体积的异丙醇 或2倍体积的乙醇。
二、引物（primer) 设计 ①位置 与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列 互补（ 5‘端相同）的短DNA。
3’ 3’
引物设计现在多用专业软件 如Primer5.0等
②引物的长度
一般引物设计为长18—30bp。
但苯酚会残留在DNA溶液中。
（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。
以上试剂有商业试剂盒； 也可以自己配制。
（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤
第一步：悬浮菌体 使用“溶液Ⅰ”悬浮菌体。 Solution I 的配制：
25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA，
第二步：破膜，蛋白质和DNA变性
溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。 Solution II 的配制：
0.2N NaOH，1.0%SDS
第三步：中和 溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复 合物和染色体DNA沉淀。 Solution III的配制：
5M 乙酸钾（用冰醋酸调pH至4.8）
第四步：离心除去沉淀 上清液中含有闭合质粒DNA。
SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并 结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质 （包括DNA酶）变性沉淀。
④ KAc-HAc缓冲液 冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 高浓度的K+置换Na+,生成不溶的PDS
⑤ 乙醇 用于沉淀DNA。 DNA分子以水合状态“溶于”水里， 乙醇能夺去DNA分子的水环境。
primer1 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’
3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer2
⑥引物的Tm值 Tm值是指溶液中有半数的DNA分子解链为 单链时的温度。两条引物的Tm值尽可能相 等或相近，最好相差不超过2 oC。
经验公式计算： Tm=（G+C)4 + (A+T)2
实际复性温度选择低于Tm值5-10 oC。
通过抗体与靶蛋白的抗原特异性反应检 测蛋白质样品。 主要用于基因在蛋白质水平上的表达研 究。
Western blot的原理与Southern blot相比 有两点不同:
(1) 检测的对象不同. (2) 探针的性质不同,在Western blot中使
用的探针是抗体(蛋白质)
原理和方法:
双链DNA
限制性内切酶 消化
电泳分离
放射自显影
检测
洗膜
杂交 转膜
NaOH变性
NaOH或高温变性
标记的探针
应用: ➢ 基因拷贝数检测; ➢基因筛选, 获取目的基因; ➢遗传疾病诊断; ➢转基因样品检测, 等…
2、Northern blot
原理和方法: 是相对于Southern blot而命名的。 利用 DNA-RNA链或RNA-RNA链杂交的原理， 通过DNA（或RNA）探针检测RNA样品。
此时进行二步PCR，第二级PCR需另行设置反 应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的 位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物 做模板，进行第二步不饱和PCR扩增，这样只 有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物 扩增。
除了提高PCR的产量外，还提高了最终产 物的特异性。
为了增加产物的特异性，设计2组引物（套嵌引 物），结合位点依次位于前一组引物之间，进行2 轮扩增。第一轮的PCR产物稀释100-200倍作为下 一轮的扩增模板，进行不饱和扩增（10-15 cycles）。
单链RNA
变性胶电泳分离
放射自显影
检测
洗膜
杂交 转膜
NaOH或高温变性
标记的探针
应用: 主要用于基因在转录水平上的表达研究。 ➢基因时空特异性表达，及表达模式分析； ➢候选基因表达分析，有利于排除候选 基因，等…
物理图谱
CRG2(2)
CR.8 kb
3’
5’
5’
引物少3’
低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后 只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后 产物中99%是单链DNA。
（5）不对称PCR
②退火温度不对称
一条引物长，另一条引物短
PCR时，先是低温退火，一定循环后， 提高退火温度，使短的引物不能结合模 板，达到产生单链。
（6）反向PCR 扩增两个引物外侧的未知序列
变性
碱裂解法
利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA 的结构状态的差异来提取质粒DNA。
当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质 粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。
当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配 置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与 破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物， 被SDS包盖。
3’
template
5’
5’
template
3’
（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。
技术关键： 把线性DNA模板转变成环形分子。
使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。
（7）TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced PCR )
已知序列
5’ 3’
P1 P2 P3