健脾益智胶囊对大脑中动脉栓塞大鼠脑梗死体积和ATP酶活性的影响

健脾益智胶囊对大脑中动脉栓塞大鼠脑梗死体积和ATP酶活
性的影响
谢越;冯珂;纪立金
【摘要】[目的]探讨健脾益智胶囊对大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠脑梗死体积和ATP酶活性的影响。

[方法]选取135只SD大鼠随机分为正常组、模型组、中药组,采用线栓法建立MCAO大鼠模型,中药组予健脾益智胶囊干预,各组于术后6h、
12h、1d、3d、7d,采用TTC染色法计算脑梗死体积,采用定磷法测定大鼠脑组织
中Ca2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶的活性水平。

[结果]中药组梗死体积与模型组比较显著缩小,模型组术后1d的梗死体积最大(P<0.05);术后6h、12h、1d、3d,
与正常组相比,模型组术后Na+-K+-ATP酶活性显著降低(P<0.05);术后6h、12h、7d,与模型组相比,中药组Na+-K+-ATP酶活性显著增强(P<0.05)。

术后6h、12h、3d与正常组相比,模型组Ca2+-ATP酶活性显著降低(P<0.05);术后6h、3d、7d,
与模型组相比,中药组Ca2+-ATP酶活性显著增强(P<0.05)。

[结论]健脾益智胶囊
可缩小大鼠脑梗死体积,可能与增加ATP酶活性有关。

【期刊名称】《广西中医药大学学报》
【年(卷),期】2017(020)004
【总页数】4页(P1-4)
【关键词】健脾益智胶囊;大脑中动脉栓塞;栽栽悦染色法;ATP酶
【作者】谢越;冯珂;纪立金
【作者单位】[1]福建中医药大学,福建福州350122;;[1]福建中医药大学,福建福州350122;;[1]福建中医药大学,福建福州350122
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
脑卒中是全球第二大死亡原因，在缺血性卒中患者中，约有70%将会终身承受半
身不遂、手脚麻痹、语言障碍、痴呆等后遗症的痛苦，具有高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率的特点。

缺血性卒中后脑水肿的发生是导致患者死亡的主要原因，病理机制至今尚未完全阐明。

缺血再灌注脑组织的主要病理学表现为出现梗死区域以及脑水肿。

由于脑水肿和脑细胞坏死是脑功能障碍的主要原因，脑细胞坏死后不可逆，因而防治脑水肿则是临床上治疗卒中的重点。

本实验通过观察健脾益智胶囊对大脑中动脉栓塞（MCAO）模型大鼠缺血侧脑组织梗死体积和大鼠 Na＋－K＋－ATP 酶、Ca2＋－ATP 酶活性的影响，探讨其对减轻脑水肿、防治缺血性脑卒中的作用机制。

1 材料与方法
1．1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠135只，13周龄，体质量280～300 g，由上海斯莱克实验动物中心提供，许可证号：SCXK（沪）2007－0005。

适应性
饲养6 d后，按数字编号法随机分为正常组、模型组、中药组各45只。

每组按实验设计存活时间再分为以下各亚组：6 h、12 h、1 d、3 d、7 d 等组，每组 9只。

1．2 试剂与仪器超微量ATP酶测试盒（测Ca2＋－ATP酶，南京建成生物工程
研究所，Lot No．XSD2017070017．i）；超微量ATP酶测试盒（测Na＋－K
＋－ATP酶，南京建成生物工程研究所，LotNo．XSD2017070017．i）；Thermo scientific BCA 法测定蛋白浓度试剂盒（Lot No．RF234184）；TTC
粉（美国Sigma公司，Lot#E1605121）；10%水合氯醛（Aladdln Industrial Corpora tion，Lot#E1605121）；电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司，DAP－9082）；多聚甲醛（美国Sigma公司，Lot#HMBF 4669v）；超声波细
胞粉碎仪（美国 SONICS＆MATERIALS INC）；TDZ4－WS低速台式离心机
（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；水浴恒温箱（上海精宏实验设备有限公司）；电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；多功能酶标仪（TECAN Austria GmbH，M200PRO）。

1．3 药物健脾益智胶囊由人参10 g、黄芪20 g、白术20 g、制何首乌15 g、
石菖蒲6 g、远志6 g、水蛭3 g组成（中药材购自福建中医药大学国医堂，由福建中医药大学制药厂代加工成胶囊）。

胶囊每粒内容物重0．3 g，1 g内容物相
当于含生药品10 g，再加入0．9%氯化钠溶液制备成健脾益智胶囊混悬液（0．2 g/ml）。

1．4 MCAO模型复制与给药参照文献［1］方法复制模型：大鼠以10%水合氯
醛溶液（350mg/kg）腹腔麻醉，仰卧固定于实验台上，颈部常规备皮消毒，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）。

结扎CCA近心
端及ECA，由CCA近分叉处剪一小口，将一头端烧制成球状的尼龙线（长
50mm，直径0．24mm）从CCA主干切口缓慢向ICA入颅方向推进，以CCA
分叉处为标记，推进18～20mm左右感到轻微阻力时停止，扎紧并固定尼龙线，缝合皮肤。

术后2 h参照Bederson评分法［2］进行行为学评分，2分以上的大
鼠纳入研究，死亡不足者随即补入。

中药组术后2 h给予健脾益智胶囊混悬液［0．735 g/（kg·d），按体表面积换算］，灌胃给药，每天1次。

模型组、正常组予常规饲养。

此后分别于术后6 h、12 h、1 d、3 d、7 d 处死取材。

1．5 脑梗死体积测量方法将正常组、模型组、中药组每组按存活时间分为 6 h、12 h、1 d、3 d、7 d 亚组，每组取 3 只，处死大鼠，经麻醉后直接取脑，在－
20℃冰箱中速冻20min左右，达到一定硬度后取出，去除嗅球、小脑和低位脑干，放在切片板上，作2mm厚度的连续切片，共计5片。

将切片置于2%的TTC染
色液中，严格避光，放入37℃温箱15～30min，均匀染色，再用4%多聚甲醛固定，正常脑组织会被染成红色，白色为梗死脑组织，将染色的脑片按切片顺序排列，标号，并拍照，利用Image J（版本1．42）图像处理软件计算脑梗死体积。

首先计算每个层面脑片的梗死面积，再将各脑片梗死面积之和乘以厚度（2mm）为总
的梗死体积［3］。

校正梗死体积百分比＝（对侧脑组织体积－缺血侧正常脑组织体积）/对侧脑组织体积×100%。

1．6 脑组织酶活性检测将正常组、模型组、中药组每组按存活时间分为 6 h、12 h、1 d、3 d、7 d 亚组，每组取 6 只，大鼠麻醉后，断头取左侧脑组织，准确称取组织重量，按重量（g）∶体积（m l）＝1∶9的比例，加入 9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2 500 r/min，离心10min，取上清液（即10%）
的匀浆上清液，再用生理盐水10倍稀释成1%，同时用BCA蛋白弄苏测定试剂盒（BCA Protein Assay Kit）测定组织蛋白浓度。

如果预试结果太高，再将1%的
组织匀浆稀释成不同浓度进行预试后再决定取样浓度。

严格按照试剂盒说明，测定脑组织 Na＋－K＋－ATP 和 Ca2＋－ATP 酶的活性。

1．7 统计学处理采用SPSS 20．0软件统计分析，计量资料用均数±标准差（）
表示，作单因素方差分析和t检验，以P＜0．05 为有统计学意义。

2 结果
2．1 健脾益智胶囊对脑组织梗死体积百分比的影响见表1和图1。

正常组无梗死体积，中药组各时间点梗死体积百分比与模型组比较显著缩小（P＜0．05）；模
型组术后1 d的梗死体积百分比最大，与组内术后6 h、12 h、3 d和7 d相比较，差异显著（P＜0．05）。

表1 各组MCAO大鼠脑组织梗死体积百分比的比较（%，）注：与模型组比较，
①P＜0．05；与模型组术后 1 d 比较，②P＜0．05组别 6 h（n＝3） 12 h（n
＝3） 1 d（n＝3） 3 d（n＝3） 7 d（n＝3）模型组 48．67±1．53②
47．00±2．00② 64．00±3．00 51．67±1．53② 49．33±3．06②中药组26．33±2．31① 27．67±3．21① 35．67±5．13① 24．67±1．15① 25．00±2．00①
图1 各组术后1 d脑梗死情况
2．2 健脾益智胶囊对Na＋－K＋－ATP酶活性的影响见表2。

2．3 各组干预后Ca2＋－ATP酶活性比较见表3。

3 结论
1958年开始用TTC来染色检测哺乳动物组织的缺血梗死［4］。

2，3，5－氯化
三苯基四氮唑（2，3，5－triphenyltetrazolium chloride，TTC）为脂溶性光敏
感复合物，是呼吸链中吡啶－核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中完整的线粒体氧化酶系反应，诱发产生深红色，使正常组织染色，而缺血组织的线粒体损伤，脱氢酶活性下降，不能诱导染色反应，因而不会产生变化呈苍白色［5］。

其根据正常与梗死脑组织染色的不同计算梗死体积，是目前应用最广泛的测量方法。

本实验将TTC应用于MCAO大鼠脑组织上，为健脾益智胶囊治疗缺血性脑卒中提供科学依据。

实验结果表明：大脑中动脉栓塞再灌注会造成大鼠脑神经细胞迟发型死亡和再灌注损伤，其病理改变随着时间的延长而加重最后达到高峰期，一般在12～24 h时达到极期，所以模型组术后1 d梗死体积百分比最大。

此外，与模型组相比，经健脾益智胶囊治疗后的MCAO大鼠梗死体积明显缩小（P＜0．05）。

在生理条件下，细胞外Na＋浓度介于130～145mmol/L，而细胞内Na＋浓度仅10mmol/L左右，细胞内外Na＋电化学梯度在10倍以上，Na＋有不断入侵细胞内的倾向。

细胞内Na＋的恒定依赖细胞膜 Na＋－K＋－ATP 酶活性的维持。

Na
＋－K＋－ATP 酶的主要功能是将细胞内的Na＋泵出和将细胞外的K＋泵入，平
衡细胞内外Na＋和K＋浓度。

Ca2＋－ATP酶则是一种维持细胞内外Ca＋浓度平衡的 Ca2＋泵，它同 Na＋－Ca2＋交换共同维持细胞内Ca2＋稳态。

脑缺血时，脑细胞氧化磷酸化功能降低，细胞内线粒体受累，而导致ATP含量严重减少，引起Na＋－K＋－ATP酶和和功能起着十分重要的作用。

实验结果表明：经健脾益智胶囊治疗后，Na＋－K＋－ATP 酶和 Ca2＋－ATP 酶活性明显增高，尤其在中药治疗7 d后，效果最佳，提示健脾益智胶囊的作用具有明显的时间相关性，可能与药物的代谢有关，具体机制有待于进一步研究。

Ca2＋－TP酶活性下降，导致K＋大量流向细胞外液，同时钠泵活力降低，可造成细胞内钠含量增高，再灌注时缺血的细胞重新获得氧及营养物质供应，细胞内高Na＋除激活钠钾泵外，还迅速激活 Na＋/Ca2＋交换蛋白，以加速Na＋向细胞外转运，同时引起细胞内Ca2＋转运失常，胞浆内的Ca2＋大量沉积于细胞内，细胞内钙超载，导致细胞内多种降解酶被激活、释放，引发细胞急速肿胀，产生细胞毒性脑水肿［6］。

因此，Na＋－K＋－ATP酶和Ca2＋－ATP酶能够改善能量代谢水平以及抑制细胞内的钙超载［7－8］，对维持细胞内离子浓度、维持细胞的正常结构
表2 各组大鼠脑组织Na＋－K＋－ATP酶活性比较（μ/mg prot，x± s）注：与正常组比较，①P＜0．05；与模型组比较，②P＜0．05；与同组术后 1 d 比较，③P＜0．05?
表3 各组大鼠脑组织Ca2＋－ATP酶活性比较（μ/mg prot，x± s）注：与正常组比较，①P＜0．05；与模型组比较，②P＜0．05；与同组术后 1 d 比较，③P ＜0．05?
中医认为脾藏意，主思，生智，脾于五行中属土，故能化生万物，脾胃为人体气机升降的枢纽，脾主运化，既能将其化生的水谷精微直接充养脑髓，同时也具有运化水饮的作用。

脾气将水饮化为津液，并将其吸收、转输到全身脏腑，人体一身津液的输布代谢都离不开脾气的作用，所以脾的这种“运化”作用对于脑水肿也同样具
有重要的调节作用。

中风多发于老年人，其脏腑虚衰，脾失健运，痰浊内生，气机阻滞而血瘀，《血证论》有云“血在上则浊蔽而不明矣”，瘀浊之胃病，蕴积日久而成毒，痰浊闭阻清窍，瘀毒损伤脑络，发为中风病［9］。

健脾益智胶囊由人参、黄芪、制首乌、石菖蒲、远志等药物组成。

全方以人参、黄芪大补脾气为君；制首乌、石菖蒲等补精填髓、豁痰醒脑、祛瘀通络之品为臣，共助君药增加健脾之功效；佐以远志益智宁神，交通心肾［10－13］。

诸药相伍，共奏健脾补精、化瘀益智
之效，以达标本同治之目的。

本研究结果表明健脾益智胶囊能有效缩小MCAO大鼠脑梗死体积，增强Na＋－K＋－ATP酶和Ca2＋－ATP酶活性，提示健脾益智胶囊可能是通过增加Na＋－K＋－ATP 酶和 Ca2＋－ATP 酶活性来达到减轻脑水肿的，然而健脾益智胶囊通过何种途径增加 Na＋－K＋－ATP 酶和 Ca2＋－ATP
酶活性尚不明确，还需要进一步的研究探讨。

参考文献
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