自噬对持续性正加速度暴露大鼠beclin-1、lc3-Ⅱ表达水平及学习记忆、

•论著•
自噬对持续性正加速度暴露大鼠Beclin-1、L C3-n 表达水平及学习记忆、行为能力影响研究
武岳\于卉影2
北部战区总医院1.卫勤部;2.医学实验科，辽宁沈阳110016
[摘要]目的探讨自噬对持续性正加速度（+G z)暴露大鼠Bedin-l、LC3-n表达水平及学习记忆、行为能力的影响。

方法选取30只体质量180〜200 g的雄性SD大鼠，按体质M配对原则将大鼠随机分为对照组（CON组）、+ 10 Gz/3 min暴 露后即刻组（+ 丨〇Gz/3 min 组）、+ 10 Gz/3 miii 暴露后1(1组（+ 10 Gz/3 min 1d 组）、+ 丨0 Gz/3 min +3-MA 组、+ 10 Gz/ 3 min 1d+3_MA组，每组各6只。

采用免疫蛋白印迹和逆转录-聚合酶链反应法检测脑组织自噬相关基因Beclin-1、LC3-II 的蛋白表达水平和mRNA相对表达量，通过行为学实验观察大鼠学习记忆能力和行为能力的变化，同时观察自噬抑制剂 3-MA的干预作用。

结果+10Gz/3 min组、+ 10Gz/3 min 1(丨组Bedin-l、LC3-n蛋白表达水平、mRNA相对表达量均高于 CON 组、+ 10 Gz/3 min+3-MA 组、+ 10 Gz/3 min 1d+3-MA 组，差异有统计学意义(尸 <0.05);+10Gz/3 min 1d组 LC3-JI 蛋白 表达水平低于+ 1〇Gz/3 min组，+ 10 Gz/3 min 1d组Bedin-1、LC3-D mRNA相对表达量低于+ 10 Gz/3 min组，差异有统计学意义 (/"<0.05)。

+10 Gz/3 min 组、+ 10Gz/3 min 1d 组正确反应次数、总得分少于 CON 组、+ 10 Gz/3 min+3-MA 组、+10 Gz/3 min 1d + 3-MA 组，且+ 10 Gz/3 min 组少于 + 10 Gz/3 min 1(I 组，差异有统计学意义（P<0. 05) ; + 10 Gz/3 min 组、+ 10 Gz/3 min 1d组总反应时间、中央格停留时间长于CON组、+ 10 Gz/3 min + 3-MA组、+ 10 Gz/3 min 1d +3-MA组，且+ 10 Gz/3 min组 长于+10 Gz/3 min 1(1组，差异有统计学意义（P<0.05)。

结论脑自噬活动增强会对+ G z暴露大鼠学习记忆及行为能力 造成损伤，而抑制自噬可显著改善病情。

[关键词]持续性正加速度；自噬；大鼠
中图分类号：R852. 21 |d〇i：10. 16680/j. 1671-3826.2020.02.04 文章编号：丨67丨-3826(2020)02~0丨37~04
Autophagy of continuous positive acceleration exposed rats Beclin 1,LC3-II expression level and the learning and memory, behavior and ability to impact study
WU Yue,YU Hui-ying( 1. Department of Medical Service,General Hospital of Northern Theater Command,Shenyang 110016,China；
2. Department of Medical Experiment,General Hospital of Northern Theater Command,Shenyang 110016,China)
Abstract ：Objective To investigate the autophagy- of continuous positive acceleration( +Gz) exposed rats Beclin 1 , LC3- II expres­sion level and the ability of learning and memory, behavior. Methods Thirty male SD rats with a l)o(Jy mass of 180 〜200 g were se­lected and randomly divided into the control group( CON group) ，+ 10 Gz/3 minutes immediate group( + 10 Gz/3 minutes group) ，+ 10 Gz/3 minutes 1day group( + 10 Gz/3 minutes 1day group) , + 10 Gz/3 minutes +3-MA group and + 10 Gz/3 minutes 1day + 3-MA group. By using immune protein imprinting and reverse transcription-polymerase chain reaction method to detect brain autophagy related gene Beclin 1 ,LC3- I I protein expression levels and relative expression of mRNA,rats were observed by behavioral experiments the change of learning and memory ability and behavior ability,at the same time observe autophagy inhibitor S-MA^ intervention. Re­sults Beclin 1 , LC3-II protein expression level and mRNA expression in +10 Gz/3 minutes group and + 10 Gz/3 minutes 1day group were higher than those in the CON group, + 10 Gz/3 minutes +3-MA group and + 10 Gz/3 minutes 1day + 3-MA group，and the difference was statistically significant(P < 0. 05). LC3-II protein expression level in the + 10 Gz/3 minutes 1day group was lower than that in the + 10 Gz/3 minutes group(P<0. 05). Beclin-1 ,LC3- II mRNA expression levels in the + 10 Gz/3 minutes 1day were lower than those in the + 10 Gz/3 minutes group (P<0. 05). The correct reaction times and total scores in the + 10 Gz/3 minutes group and + 10 Gz/3 minutes 1day group were less than those in the CON group, + 10 Gz/3 minutes +3-MA group and + 10 Gz/ 3 minutes 1day +3-MA group(P <0. 05). The time and scores in the + 10 Gz/3 minutes group were less than those in the + 10 Gz/ 3 minutes 1day group( P <0. 05). The total reaction time,central lattice residence time in the + 10 Gz/3 minutes group and + 10 Gz/ 3 minutes 1day group was longer than that in the CON group, + 10 Gz/3 minutes +3-MA group and + 10 Gz/3 minutes 1day +3-MA group(P <0. 05) and the time in the + 10 Gz/3 minutes group was longer than that in the + 10 Gz/3 minutes 1day group ( P< 0. 05). Conclusion Enhanced autophagy activity in the brain ran damage learning, memory and behavior ability of + Gz exposed rats,while inhibiting autophagy can significantly improve the condition.
Key w ords：-f Gz；Autophagy ；Rat
基金项目：辽宁省自然科学基金（20170540979)
第一作者:武岳（1987-)，女，辽宁沈阳人，主治医师，硕士
通信作者：于弁影，E-m ail: hyingy@ sina^ com
随着现代战机机动性能的不断提髙，尤其在我 军第5代隐形战机歼-20列装之后，飞行员在操作 过程中受到的持续性正加速度（+G z)威胁进一步 增加，其可导致机体脑水平动脉压降低、脑血流量 减少，进而引起脑缺血和缺氧，最终损伤脑组织结 构和功能，严重影响飞行安全+3]。

有研究表明，+ Gz暴露可导致大鼠脑组织结构和功能发生显著 改变，+ 10 Gz/5 m in暴露后可观察到大鼠顶叶皮层 锥体细胞层、海马C A1区及丘脑下部神经元形态和 细胞超微结构改变[3]。

另有研究通过测量大鼠寻 找水下平台所用时间证实，+G Z暴露可致大鼠学习 记忆功能出现障碍141,但其作用机理尚未完全阐明。

自噬是一种维持细胞新陈代谢平衡的重要生 理过程，可降解细胞内受损细胞器、错误折叠的大 分子物质及其他毒性成分，实现细胞内环境稳定。

有研究发现，自噬激活与神经元损伤后动物学习记 忆能力下降密切相关,抑制自噬可保护受损神经细 胞并显著改善学习记忆功能。

本研究以+ G z暴 露大鼠为动物模型，检测其脑组织自噬相关基因
B eclin-1、L C3-I I的表达情况，并观察自噬抑制剂
3 -M A对模型大鼠学习记忆和行为能力的影响。

现 报道如下。

1材料与方法
1.1+Gz大鼠模型构建选取30只体质量180 ~ 200 g的雄性SD大鼠（空军军医大学实验动物中心 提供），采用12 h光照/12 h黑暗模式，在专门的动 物室适应性词养1周，每天自由饮食、饮水。

1周后，按体质量配对原则将大鼠随机分为对照组(CON组）、+ 10 Gz/3 min暴露后即刻组（+ 10 Gz/ 3 m in组）、+ 10 Gz/3 min 暴露后 1d组（+ 10 Gz/ 3 m in 1d组）、+ 10 Gz/3 m in + 3-MA 组、+ 10 Gz/ 3 m in 1d+3-MA组，每组各6只，取5组大鼠的脑 皮层组织待测。

+ G z大鼠模型构建方法参考文献[7]。

+ 10 Gz/3 min + 3-MA 组、+ 10 Gz/3 m in 1d+3-MA组采用灌胃法于每天固定时间给予大 鼠 3-MA 30 m g/kg,连续 14 d。

1.2B eclin-1和LC3-I I蛋白表达检测将冻存的5组大鼠相同部位脑皮质组织置于细胞裂解液中勻 浆，于41下13 000 r/in in离心10 m in后取上清液。

米用B C A试剂盒进付蛋白定量，并取40jxg蛋白 在 Invitroge丨14 ~ 120 g/L SDS-PAGE 系统中进行蛋 白电泳。

电泳结束后,采用半湿转法将蛋白转移至 P V D F膜上。

脱脂奶粉封闭5 h后，加人抗LC3-II (1 : 1000)、抗 Beclin-1 ( 1 : 1000 )或抗GAPDH (1:600) —抗后，4T孵育过夜。

其后加人H R P标 记的二抗（1:12 000)孵育90 min。

最后浸人ECL 发光液进行发光显影，经凝胶成像系统扫描并分析。

1.3 Beclin-1和LC3-II mRNA表达检测取冻存脑组织，按总RN A提取试剂盒说明提取大鼠脑组 织总RNA,并检测样品纯度和总RN A浓度。

采用 TaKaRa逆转录试剂盒进行逆转录-聚合酶链反应，合成cDNA,并进行聚合酶链反应。

引物序列见表 1。

反应条件：94丈，30 S;52^C，50 s;72t；，60 s; 35个循环。

最后,聚合酶链反应产物以1.5%琼脂 糖凝胶电泳进行检测。

表1逆转录-聚合酶链反应引物序列
基因引物长度LC3-n5;-AGC TTC GAA CAA AGA GTG GAA G-3'
5，-TAC ACT TCA GAG ATG GGT GTG G-3;
263 bp
Beclin-15，-GCT CAG TAC CAG CGA GA-3'
5^-ACA GTA CAA CGG CAA CTC-3,
381 bp
GAPDH5'-ACA GCA ACA GGG TGG TGG AC-3'
5'-TrT GAG GGT GCA GCG AAC TT-3,
252 bp
1.4 Y型迷宫实验Y-型迷宫控制器由本实验室 自行研制[7]。

实验开始时，大鼠置于迷宫非安全区 任意支臂，适应环境1min。

安全臂灯亮为条件信 号，指示大鼠跑向该臂。

此时开始计时，不亮灯的 两支臂及连接区开始通电（直流电，电压40 V)，在 电击作用下驱使大鼠逃往安全臂，以大鼠到达安全 臂所用时间作为1次学习训练所用反应时间。

再 以顺时针方向的下一支臂作为安全臂进行测试，按 照上述方法循环测试。

同时，测试中的大鼠从起步 区直接进人安全区的情况记为正确，而通过其他区 域乱窜后再进入安全区的情况记为错误。

记录 各组大鼠15次学习训练所用的总反应时间和正确 反应次数。

1.5旷场分析实验将大鼠置于旷场反应箱正中方格，观察3 m in内大鼠的活动情况[7]。

记录各组 大鼠中央格停留时间和总得分。

总得分为跨格次 数（三爪以上跨人邻格的次数）和站立次数（两前肢 离地1cm以上）之和。

该实验的测量时间点与Y 型迷宫实验相同。

1.6 统计学方法采用Graphpad Prism及SPSS
Beclin-1 LC3-H B -actin
2.35组大鼠学习记忆及行为能力指标比较Y型 迷宫实验结果表明，+ 1〇Gz/3 m in组、+ 10 G z/ 3 min 1d组正确反应次数少于C O N组、+ 10 G z/ 3 min +3-MA 组、+ 10 Gz/3 min 1d + 3-MA 组，且 + 10 Gz/3 min 组少于 + 10 Gz/3 min 1d 组,差异有 统计学意义（P< 〇. 05 );+10 Gz/3 min 组、
+ 10 Gz/3 min1(1组总反应时间长于CON组、+ 10 Gz/3 min + 3-MA 组、+ 10 Gz/3 m in1(I + 3-MA组，且 + 10 Gz/3 m in 组长于 + 10 G z/3 m in 1t丨组，差异有统计学意义（Z3 <〇.〇5); + 10 Gz/ 3 m in+ 3-MA组、+10 Gz/3 min 1d+ 3-MA组正确 反应次数、总反应时间与CON组比较，差异无统汁
2. 2 5组大鼠脑组织Beclin-1、LC3- II mRNA相对 表达量比较 + 10 Gz/3 m in 组、+ 10 Gz/3 m in 1(1组86<;加-丨、1^：3-111111^1^相对表达量均高于 CON组，也高于 + 10 Gz/3 m in+3-MA组、+ 10 Gz/ 3 m in1d + 3-M A组，差异有统计学意义（尸< 0.05); +10 Gz/3m in丨d组 Beclin-1、LC3-U mRNA相对表达量低于+ 10 Gz/3 min组，差异有统 计学意义（P <〇.〇5)。

+ 10 Gz/3 m in +3-MA 组、+ 10 Gz/3 min 1d+ 3-MA组 Beclin-1、LC3- II mR-N A相对表达量与CON组比较，差异无统计学意义 (尸>0.05)。

见图 2。

17.0统计学软件对数据进行处理。

计量资料以均 数±标准差(* ± .0表示，组间比较采用 < 检验。

以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.I5组大鼠脑组织Beclin-1、LC3- II蛋白表达水 平比较 + 10 Gz/3 m in 组、+ 10 Gz/3 m in 1c l 组 Beclin-1、LC3- U蛋白表达水平均高于CON组，也高于 + 10 Gz/3 m in + 3-MA 组、+ 10 Gz/3 m in 1(1 + 3-MA组，差异有统计学意义（/^<0.05); +10 Gz/ 3 m in 1(丨组LC3-1I蛋白表达水平低于+ 10 Gz/ 3 min组，差异有统计学意义（P<0.05)。

+10 Gz/ 3 m in+ 3-MA组、+ 10 Gz/3 m in 1 (1+ 3-MA组 Bec-lin-1、LC3-n蛋白表达水平与CON组比较，差异无 统计学意义（Z3>0.05)。

见图
1。

学意义（P >〇.〇5)。

旷场分析实验结果表明，+ 10 Gz/3 min组、+ 10 G z/3 m in 1d组总得分少于 CON 组、+ 10 G z/3 m in + 3-MA 组、+ 10 Gz/3 m in 1(U3-MA 组，且 + 10 G z/3 mi丨i 组少于 + 10 G z/ 3 m in 1d组，差异有统计学意义（P< 0.05); + 10 Gz/3 m in组、+ 10 G z/3 m in 1d组中央格停留时间长于CON 组、+ 10 Gz/3 m in+ 3-MA组、+ 10 Gz/3 m in 1d + 3-MA 组，且 + 10 Gz/3 m in 组 长于+ 10 Gz/3 m in 1d组，差异有统计学意义（P< 0.05) ;+ 10 Gz/3 m in + 3-MA组、+ 10 Gz/3 m in 1d + 3-MA组中央格停留时间、总得分与CON组比较，差异无统计学意义（P>〇.〇5)。

见表2。

表2 5组大鼠学4乙及行为能力指标比较U ±.0
Y型迷宫实验旷场分析实验ITtE.
正确反应次数/次总反应时间A中央格停留时间/m in总得分/分CON组7. 7 ±0. 9^444. 0 ±40. 5_ 4. 1±1.0®®65. 3 ±8. 1_ +10 Gz/3 min 组 1.7 ±0.7728. 4 ±38.767. 3 ±8.08. 1± 1.4 +10 Gz/3 min 1(1组 4.3±1.51527.3 ±33. 2®24. 1±5. 3®38. 8 ±7.0®+ 10 Gz/3 min + 3-MA 组 6. 7 ±0.9_437. 1±26. 9®®7.9±1.6(M)62. 2 ±2.9®®+ 10G z/3 min 1d+3-M A 组7.3±1.3®®406. 8 ±53. 4①® 5. 4±1.4®®68. 2 ±8. 9®®注：与+ 10 Gz/3 min 组比较，_J> <0.05;与+10 Gz/3 min 1d 组比较，②P <0.05
3讨论
近年来，有多项研究发现，脑自噬活动增强与 学习记忆功能损伤密切相关[~。

洪铭岩[8]研究表 明，抑制JN K信号通路可减少死亡神经元数量，改 善大鼠学习记忆功能，其机制可能为抑制JN K信号 通路可降低脑自噬水平。

陈禹廷等[5研究发现，抑 制JN K信号通路可抑制过度激活的脑自噬活动，从 I衍保护蛛网膜下腔出血大鼠海马区神经细胞，对大 鼠的学习记忆功能发挥积极保护作用。

本研究结 果中，+ 10 Gz/3 m in组、+ 10 Gz/3 m in 1d 组 Bec-lin-l、LC3-1I蛋白表达水平、mKNA相对表达量均高 于CON组，差异有统计学意义< 0.05);且 + 10 Gz/3 m in1d组LC3-I I蛋白表达水平低于+ 10 Gz/3 m in 组，+ 10 Gz/3 m in 1(1 组 Bedin-]、LC3-1I niRNA相对表达量低于+ 10 Gz/3 min组，差异有统计学意义（厂<〇.〇5)。

这提示，+〇2暴露 可激活大鼠脑自噬活动，且自噬活动增强随着+ Gz 暴露后恢复时间的延长而有所缓解。

同时，Y型迷 宫实验和旷场分析实验结果表明，+ G z暴露大鼠学 习记忆能力和行为能力受损，损伤随着+ G z暴露后 恢复时间的延长而有所改善。

为进一步阐明自噬 活动增强与学习记忆、行为能力受损之间的关系，本研究采用自噬抑制剂3-M A对大鼠进行灌胃处 理,再次检测结果显示，+ 1〇Gz/3 min组、+ 10 Gz/ 3 m in 1d组 Beclin-1、LC3-II 蛋白表达水平、m F JIN A 相对表达量均高于+ 1〇Gz/3 m in + 3-M A组、
+ 10 Gz/3 m in 1d +3-M A组，差异有统计学意义 (P<0.05)。

这提示，大鼠脑自噬活动受到显著抑 制。

Y型迷宫实验和旷场分析实验结果也提示，抑
制自噬可显著改善+G Z暴露大鼠学习记忆及行为
能力，即脑自噬活动增强参与了 + Gz暴露大鼠学习
记忆及行为能力损伤过程。

综上所述，脑自噬活动增强会对+ G z暴露大鼠
学习记忆及行为能力造成损伤，而抑制自噬可显著
改善病情。

参考文献：
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(收稿口期:2020~0丨43 ;本文编辑:关婷婷）。