子宫内膜异位症SCID小鼠动物模型的构建

子宫内膜异位症（简称内异症）是育龄期妇女最常见的妇科疾病之一．近年来其发病率逐年上升，但迄今其病因及发病机制尚不明确．啮齿类动物中裸鼠及SCID小鼠是严重的免疫缺陷小
Journal of Kunming Medical University CN53-1221R
昆明医科大学学报2018，39（1）：30耀34
子宫内膜异位症SCID小鼠动物模型的构建
任旭１），王沂峰２），戴丽冰３）
（1）南方医科大学南海医院妇科，广东佛山528244；２）南方医科大学珠江医院妇产科，广东广州510228；３）广州市红十字会医院创研所，广东广州510220）
［摘要］目的构建子宫内膜异位症（内异症）裸鼠及SCID小鼠动物模型，比较在位及异位来源的人子宫内膜组织对移植效果的影响，为内异症的药物治疗研究提供有利的动物模型基础．方法取性成熟BALB/c-nu/nu 裸鼠及SCID小鼠各30只，通过皮下移植法，将在位及异位子宫内膜移植到下腹部皮下，定期观察异位病灶的大小，术后6周取出病灶，病理学检查．结果裸鼠及SCID小鼠均可建立成功的内异症动物模型．其中SCID小鼠的建模成功率较裸鼠更高（86.7%vs66.7%）．在位子宫内膜组种植的成功率明显高于异位子宫内膜组（100%vs
84.2%）．结论SCID小鼠在位内膜皮下种植方法可成功建立内异症动物模型．
［关键词］子宫内膜异位症；SCID小鼠；裸鼠；动物模型；在位内膜
［中图分类号］R711［文献标志码］A［文章编号］2095－610X（2018）01－0030－05
The Establishment of SCID Mice Model on Endometriosis
REN Xu１），WANG Yi-feng２），DAI Li-bing３）
（1）Dept.of Gynaecology，Nanhai Hospital of Southern Medical University，Foshan Guangdong528244；２）Dept.of Obstetrics and Gynecology，Zhujiang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou Guangdong 510228；３）Institute of Traumatology and Surgery of the Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou
Guangdong510220，China）
［Abstract］Objective To set up a favorable animal model for the drug treatment research of endometriosis by establishing the animal model of endometriosis in SCID and nude mice so as to compare the influences on implantation of human endometrial tissue derived from the eutopic and ectopic sources.Methods Eutopic and ectopic endometrium were transplanted to the lower abdominal parts subcutaneously of30sexually matured BALB/c-nu/nu nude mice and SCID mice respectively.The ectopic lesion sizes were under the regular observation before they were removed6weeks after the operation for pathological examinations.Results Nude mice and SCID mice were able to be used to establish a successful animal models of endometriosis.The success rate of SCID mice was higher than that of nude mice.The success rate of the eutopic endometrium group was significantly higher than that of the ectopic endometrium group.Nude and SCID mice endometriosis implantation models were successfully established.The modeling success rate of SCID mice is higher than that of the nude mice.The success rate of transplantation was higher in the ectopic endometrium than in the eutopic endometrium．Conclusion The SCID mice endometriosis endometriosis model provides a favorable animal model of endometriosis.
［Key words］Endometriosis；SCID mice；Nude；Animal model；Endometrium
［基金项目］广东省科技计划基金资助项目（20140212）；广州市医药卫生科技基金资助项目（2013A011030016）；广东省科技一般引导基金资助项目（2012B031800338）
［作者简介］任旭（1975～），女，河南郑州市人，博士，副主任医师，主要从事妇科内镜微创治疗工作.
［通信作者］王沂峰.E-mail：wyf1988@
鼠，因不存在异种间移植组织的免疫排斥反应，移植后组织成活率高，且能够保持原有的组织形态和生化特征，因此是建立内异症模型的理想动物[1-3]．本研究将构建内异症裸鼠及SCID小鼠动物模型，比较在位及异位来源的人子宫内膜组织对移植效果的影响，为内异症的药物治疗研究提供有利的动物模型基础.
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1标本来源子宫内膜组织标本取自因盆腔内异症入广州市红十字会医院妇科行腹腔镜手术治疗的患者20例，患者术前6个月未接受过激素类药物治疗，无内科并发症，术后病理证实为内异症，平均年龄（32±8）岁，月经规律．行子宫切除术的患者立即刮取子宫内膜；未行子宫切除术的内异症患者术中行刮宫术以获得新鲜的在位子宫内膜，同时部分标本取自术中卵巢子宫内膜异位囊肿剥除的新鲜囊壁组织作为新鲜的异位子宫内膜．子宫内膜标本的采集均经患者的知情同意．将在位内膜及异位内膜组织用无菌PBS漂洗3～4次，剪成约1mm的碎片，分别放入盛有适量DMEM培养液的无菌瓶后置于冰壶，准备1h内快速入实验室．
1.1.2实验动物本实验中的30只BALB/c-nu/nu 裸鼠购自中山大学动物实验中心（实验动物许可证号:SLXK（粤）2004-0011，质量合格证明编号: NO.0054696），健康雌性，6～7周龄，体重19～21g．SCID小鼠由中山大学实验动物中心提供，雌性NOD-SCID小鼠30只（实验动物许可证号: SCXK（粤）2004-0011，质量合格证明编号:NO. 0057488），6～7周龄，体质量15～18g．均在SPF级标准化环境饲养．
1.1.3实验设备及试剂生物光学显微镜（MODEL ECLIPSE E400）、实验动物手术台（PT100型深圳）、电子分析天平（BS210型德国）、LEICA切片机（RM2135德国）、彩色病理图文分析系统（HMIAS-2000武汉）、游标卡尺、眼科手术器械等．1mL注射器、9号注射针头、载玻片、生理盐水、磷酸盐缓冲液（PBS）、DMEM/F12培养液、苏木素染液、伊红染液、戊二醛、75%酒精、95%酒精、亚甲基蓝等．
1.2实验方法
1.2.1造模及分组参照文献[4]提供的方法，将准备好的在位及异位子宫内膜碎屑培养液混匀后，分别抽取至1mL空针中备用．将裸鼠及SCID各分成2组：20只注入在位内膜组织碎屑培养液的为在位内膜组；10只注入异位子宫内膜碎屑培养液的为异位内膜组．
由于裸鼠全身无毛，故选取背部皮下为移植部位以便观察，消毒后用9号针头将在位或异位子宫内膜碎屑培养液按每只0.5mL注入裸鼠背部皮下．SCID小鼠则选取下腹部皮下为手术部位，消毒后以腹中线脐下为穿刺点，每只SCID小鼠注入
0.5mL在位或异位子宫内膜碎屑培养液．
1.2.2观察指标（1）观察动物的基本情况:定期测量裸鼠及SCID小鼠的体重，并观察其皮色、饮食、大小便及活动等情况．有无生病、死亡等.（2）观察子宫内膜异位病灶的大小：于药物注射部位观察皮下内异病灶结节的生长变化情况，自注射当日起，游标卡尺测量皮下异位病灶的最大直径（a）与最大横径（b），每3d一记录次．计算方式均参照肿瘤的计算公式[5]（以内异灶替代肿瘤）．体积V=a×b2×0.52．a=异位病灶长径（mm），b=异位病灶短径（mm）．
注射后6周用断颈法将实验动物处死，取出异位病灶组织．（3）显微镜下观察：移植术后常规饲养，于2周、4周取出移植物，标本经石蜡包埋、切片、HE染色，在光镜下观察，可见明显的子宫内膜腺体和间质．随种植时间延长，内膜腺体和间质的结构无明显改变．建模4周后打开裸鼠背部皮下及SCID小鼠腹部皮下，种植处异位内膜生长，有水泡形成且有黄色液体内容物者为模型建立成功．
2结果
2.1裸鼠子宫内膜异位症模型的建立
裸鼠子宫内膜异位症模型建立过程中，20只裸鼠的背部皮下注射在位子宫内膜碎屑培养液，10只裸鼠的另一侧背部皮下注射异位子宫内膜碎屑培养液，并标记分组．
肉眼大体观察：皮下注射区在注射后呈小丘形隆起，24h后注射物被吸收，隆起逐渐稍消退，第2～3d在皮下可见约2.0mm×2.0mm×1.5mm大小结节样隆起的种植异位病灶，此后逐渐增大．实验过程中死亡1只，共有20只裸鼠在种植后第10天可见5～10mm的结节（图l），建模成功率为66.7%（20/30）．
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第1期任旭，等．子宫内膜异位症SCID小鼠动物模型的构建
图1裸鼠背部皮下异位病灶
Fig.1Ectopic lesions on the back of nude
mice
图2内异症病灶组织（在位内膜种植HE×400）Fig.2Ectopic lesions tissues（eutopic endometrium implanting HE×400）图3内异症病灶组织（异位内膜种植）（HE×400）Fig.3Ectopic lesions tissues(ectopic endometrium im-planting HE×400
）
图4SCID小鼠腹部皮下内异症病灶
Fig.4Ectopic lesions of SCID mice under the abdominal
skin
图5SCID小鼠内异症病灶组织（在位内膜种植HE×400）Fig.5Ectopic lesions tissues of SCID mice（eutopic endometrium implanting HE×400）
2.1.1在位内膜组20只种植在位子宫内膜的裸鼠19只存活，1只死亡，其中16只造模成功，建模成功率为80%（16/20）．在位内膜接种四周后取出异位病灶，常规石蜡包埋，HE染色，镜下可见到子宫内膜腺体及间质．实验均由经验丰富的病理科医生阅片，鉴定为子宫内膜腺体及间质（图2）.
2.1.2异位内膜组10只种植异位子宫内膜的裸鼠全部存活，其中仅4只造模成功，建模成功率为40%（4/10）．同上方法，异位内膜接种4周以后取出背部的异位病灶，常规石蜡包埋切片，HE 染色，见部分子宫内膜腺体及间质．子宫内膜腺体较在位内膜组分布稀疏且少，大部分为纤维化组织（图3）.
2.2SCID小鼠子宫内膜异位症模型的建立
20只SCID小鼠于腹部皮下接种在位子宫内膜碎屑培养液，10只于腹部另一侧皮下接种异位子宫内膜碎屑培养液，并标记分组．大体观察：注射后皮下注射区呈小丘状隆起，12～24h培养液被吸收，隆起渐消退，第2～3天皮下出现约3.0 mm×2.0mm×2.0mm大小结节，为异位病灶，此后逐渐增大．30只SCID小鼠全部存活．其中26只SCID小鼠在注入内膜组织后第10天可见5～12 mm的结节（图4），建模成功率为86.7%（26/30）．
2.2.1在位内膜组20只种植在位子宫内膜的SCID小鼠全部存活，20只均造模成功，建模成功率为100%（20/20）．在位内膜接种4周后取出腹部皮下异位病灶，经常规石蜡包埋、切片、HE 染色，镜下可见腺体及间质．通过经验丰富的病理科医生阅片，鉴定为子宫内膜腺体及间质（图5）.
第39卷
32昆明医科大学学报
图9种植第42天内异症病灶组织（HE ×400）
Fig.9Ectopic lesions tissues on the 42nd day after
implanting （HE ×400
）
图6种植第14天内异症病灶
Fig.6Ectopic lesions on the14th day after
implanting
图7
种植第42天内异症病灶
Fig.7
Ectopic lesions on the 42nd day after
implanting
图8种植第14天内异症病灶组织（HE ×400）Fig.8Ectopic lesions tissues on the14th day after
implanting （HE ×400
）
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第1期
任旭，等．子宫内膜异位症SCID 小鼠动物模型的构建2.2.2异位内膜组10只种植异位子宫内膜的SCID 小鼠全部存活，其中6只造模成功，建模成功率为60%（6/10）．SCID 小鼠异位内膜接种4周后取出下腹部皮下异位病灶，常规石蜡包埋、切片，HE 染色，镜下可见子宫内膜腺体及间质，但较在位内膜组稀少，伴部分纤维化组织．
2.3裸鼠及SCID 小鼠两种实验动物建模成功率
的比较
同样实验条件下，经过观察裸鼠及SCID 小鼠子宫内膜异位症动物模型的构建的过程．最终裸鼠建模成功率为66.7%，SCID 小鼠建模成功率为86.7%．其中，在位内膜组，裸鼠建模成功率为84.2%，SCID 小鼠为100%；异位内膜组的裸鼠建模成功率为40%，SID 小鼠建模成功率为60%．由此可见在内异症模型的构建中，SCID 小鼠较裸鼠的建模成功率更高，更稳定可靠．2.4子宫内膜异位病灶的观察
在建模成功的裸鼠及SCID 小鼠中，定期测量移植物的大小，观察比较异位病灶的生长过程，总结异位病灶的生长规律．移植物注射后皮下呈现一过性小丘状隆起，注射后第2～3d 开始在皮下出现约2.0mm ×2.0mm ×2.0mm 大小结节样隆起种植异位病灶，此后逐渐增大．在种植第10天可见5～12mm 的结节，种植第14天后病灶（图6）大小基本稳定，异位病灶镜下可见明显的子宫内膜腺体和间质：腺上皮细胞多呈扁平或立方形，腺上皮细胞围成圆形或椭圆形的腺腔，形成腺体；病灶边缘血液供应丰富，周围有炎细胞及间质细胞浸润、结缔组织增生及玻璃样变性（图7、图8）．接种第30天后有的病灶开始出现不同程度的萎缩变小（图9）．6周后取出病灶发现，部分病灶纤维化严重，未见完整的腺细胞．
3讨论
子宫内膜异位症虽然是一种良性疾病，但该病具有复发、转移、侵袭等恶性疾病的特点．该病的病因、发病机制、病理生理、治疗方案等方面一直是妇科界的研究热点．建立内异症动物模型对揭示本疾病的发生、发展和自然病程的研究起着非常重要的作用．
在内异症的动物模型研究中以啮齿类、灵长类最多见．灵长类动物与人类的遗传背景、生殖系统
解剖最相似，且有规律的月经周期和子宫内膜脱落，理论上说是最理想的内异症模型．但它的物种稀有，价格昂贵，无法进行大规模样本的对照实验，导致研究受限．啮齿类动物价格便宜、饲养方便、来源广泛，该动物模型最常用．啮齿类动物的繁殖能力很强，动情周期较短而规律，因其无内膜脱落，所以不能自发形成异位病灶．异体移植模型则可保留人类的组织形态学，对内异症的发病机制、药物治疗方面的早期研究更有说服力[6]．在啮齿类动物中裸鼠及SCID小鼠是严重的免疫缺陷小鼠，因不存在异种间移植组织的免疫排斥反应，移植后组织成活率高，并且能够保持原有的组织形态和生化特征，因此是建立内异症模型的理想动物[7].
本实验选用裸鼠及SCID小鼠皮下移植法，将子宫内膜移植到下腹部皮下，建立内异症模型[8-9]．本研究发现裸鼠及SCID小鼠均可建立成功、有效、可靠的内异症动物模型，其中SCID小鼠的建模成功率较裸鼠更高．裸鼠是T淋巴细胞功能缺陷的动物，B细胞功能基本正常．而SCID小鼠同时具备先天性T、B淋巴细胞联合免疫缺陷的动物，是严重联合免疫缺陷小鼠，它可以克服异种间的免疫排斥反应，接受人类正常和肿瘤组织移植，使得移植后的组织仍保持原有的组织形态及生化特征，成活率较裸鼠高．SCID小鼠内异症模型性状显著且稳定，观察周期短，实验结果的临床参考意义大．国外已将SCID小鼠作为人子宫内膜组织的受体动物．但因为SCID小鼠体积较小，抵抗力低下，不能耐受多次手术及采血检测，且因免疫功能缺陷，故不能应用于内异症免疫机制方面的研究.
本实验还发现裸鼠在位内膜组移植成功率（84.2%）较异位膜内膜组移植成功率（40%）高，SCID小鼠同样在位内膜组移植成功率（100%）较异位膜内膜组移植成功率（60%）高．镜下显示种植在位内膜的病灶HE染色见丰富的子宫内膜腺体和间质；而种植异位子宫内膜囊壁的病灶HE染色仅见少量或未见子宫内膜腺体和间质，却见丰富的纤结缔组织．考虑可能与在位内膜的活性更高有关，与“在位内膜决定论”相一致．也有国外学者研究证实种植成功率与所采集的标本活性及缺氧程度密切相关[10]，有刮取卵巢巧克力囊肿内侧囊壁组织者比直接采用囊壁组织种植者成功率高．另外无论裸鼠还是SCID小鼠异位内膜种植的成功率都不是100%，有种植失败的现象．说明并非所有移植内膜均能够成活，与临床上所见70%～90%的生育龄妇女存在经血逆流，但大多数妇女不发生内异症的现象一致．
另外，通过观察本研究发现建模2周后裸鼠及SCID小鼠均开始出现含有清亮液体的囊肿（异位囊肿），而且建模第4周与第2周异位病灶的体积无明显差异，但在建模第6周大多数移植物体积缩小，出现萎缩，只有部分移植物体积增大，囊液增多．考虑这与异位内膜有一定的自然消退现象有关．
综上所述，理想的动物模型应尽可能接近人类疾病的生长进程及功能类似，并且可重复性高、规范化，能准确再现疾病的特点和发展过程，在临床上具备适用性及可控性．本实验证实SCID小鼠的在位内膜皮下种植方法方便、有效，建模成功率高，是内异症的理想动物模型．
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（2017－09－12收稿）
第39卷
34昆明医科大学学报。