转录因子KLF_4的抗癫痫作用及其机制研究

转录因子KLF_4的抗癫痫作用及其机制研究癫痫是常见的神经系统疾病,以大脑神经元异常放电活动引起的暂时性的症状或综合征（例如:强直性抽搐或痉挛性抽搐）为主要特征,通常具有持久性的发作倾向。

癫痫的病因主要是神经系统兴奋与抑制间的失衡,如神经兴奋性提高及兴奋性、抑制性的神经传导机制失衡。

目前认为,癫痫的发病机制可能涉及神经递质及其受体功能异常、离子通道功能受损、遗传因素、轴突发芽以及星型胶质细胞异常等。

这些发病机制中涉及到很多基因,由基因突变或者表达变化引起蛋白表达或功能失常都可能参与癫痫的发病。

虽然已经报道很多基因与癫痫发病密切相关,但临床上单基因遗传型的癫痫非常罕见,绝大多数情况是多种基因功能异常和外界因素协同作用的结果。

随着测序技术和CRISPR等基因编辑技术的不断成熟,各种基因在癫痫发病中的作用和致病机理也逐渐被揭秘。

转录因子在基因表达中扮演着重要的角色,但在癫痫发病机制的研究中关注得较少。

近年来,研究发现肿瘤相关的转录因子可以参与神经系统疾病的发病。

P53是肿瘤研究中非常广泛的转录因子,能激活参与促进生长停止或细胞死亡的基因。

最近的研究发现P53在癫痫的中具有非常重要的作用。

多种癫痫模型中,包括PTZ癫痫模型、红藻氨酸癫痫模型及顽固性颞叶癫痫患者,发现海马P53表达水平增加。

P53表达增加可介导神经元凋亡、增加癫痫易感性,而P53基因敲除或表达下调后可产生抗癫痫作用。

KLF₄是P53的上游蛋白,是转录抑制因子,参与氧化应激、神经炎性反应、神经再生、干细胞分化及细胞凋亡等多个神经生物过程。

海马颗粒细
胞轴突（苔藓纤维）发芽是癫痫后海马轴突再生和突触可塑性的重要表现,引起癫痫易感性增加,KLF₄是调控轴突生长最重要的转录因子。

KLF₄基因敲除后的视网膜神经节细胞在体外和体内视神经损伤后均表现出轴突再生能力增加,KLF₄过表达后显著降低了海马神经元轴突再生,而在正常生理状态下KLF₄对轴突再生是抑制的。

此外研究发现PTZ诱导的大鼠癫痫模型中,海马KLF₄蛋白表达显著降低,苔藓纤维出芽显著增加。

基于以上证据,我们认为KLF₄可能参与癫痫发病,海马神经元KLF₄过表达后可能产生抗癫痫作用。

在本研究中,我们通过行为药理学、电生理学、分子生物学和基因组学等研究方法,探究了KLF₄在癫痫发病中作用及其机制。

我们首先验证了致癫痫药物PTZ和抗癫痫药物VPA及CBZ对大鼠癫痫行为的影响及对海马KLF₄蛋白的调控。

结果显示PTZ抑制KLF₄表达,而VPA和CBZ都会使KLF₄表达增加。

接着,在小鼠PTZ模型中,我们观察到了与大鼠相同的实验结果,同时PTZ小鼠海马P53表达增加,给予VPA后P53表达降低。

在体外研究中,我们将小鼠海马锥体细胞进行原代培养,通过慢病毒感染使锥体细胞KLF₄基因过表达。

电生理记录证明PTZ可使海马锥体细胞动作电位频率显著增
加,KLF₄过表达后可显著降低PTZ诱导的动作电位频率增加。

这表明KLF₄与神经元兴奋性有关,并且KLF₄表达上调后可能产生抗癫痫作用。

进一步通过脑立体定位微量注射技术,我们在小鼠海马区过表达
KLF₄蛋白,行为学结果表明KLF₄过表达后增加了癫痫
的潜伏期。

蛋白免疫印记实验结果表明,KLF₄表达增加可直接引起
P53表达下调。

同时我们通过免疫组织化学和免疫荧光技术研究了海马区KLF₄过表达后对海马和梨状皮质c-fos表达的影响。

结果显示PTZ可显著增加海马和梨状皮质神经元c-fos表达,海马KLF₄过表达后降低了两个脑区中神经元c-fos表达,同时蛋白免疫印记实验证明了KLF₄过表达后GAD67的表达增加,对GAD65无影响。

此外,我们实验室目前正在进行与长春市七色光特殊教育机构合作进行一项癫痫及自闭症儿童的基因组学研究,目前已经完成了6名儿童的全基因组重测序,包括其中2名癫痫合并自闭症,2名自闭症及2名正常儿童。

结果发现
KLF₄ rs2236599,GABRA6 rs13184586、GABRB2 rs2808536、GABBR1 rs29225可能是与癫痫相关的SNP,GABRG2 rs211037、GABRD rs2229110和
rs28398772、SLC6A13 rs2289954、GABBR2 rs10985765和rs2304389可能与癫痫和自闭症均相关。

上述研究结果表明:KLF₄表达上调可能参与VPA和CBZ的抗癫痫作用;KLF₄表达上调后具有抗癫痫作用,KLF₄过表达后可显著降低PTZ诱导的海马锥体细胞动作电位频率增加;小鼠海马
KLF₄过表达后可显著延长癫痫潜伏期,降低PTZ引起的海马及梨状皮质c-fos过表达,这种抗癫痫作用可能通过抑制P53和激活GAD67介导。

KLF₄ rs2236599,GABRA6rs13184586、GABRB2 rs2808536、GABBR1
rs29225可能是与癫痫相关的SNP,GABRG2 rs211037、GABRD rs2229110和
rs28398772、SLC6A13 rs2289954、GABBR2 rs10985765和rs2304389可能与癫痫和自闭症均相关。

转录因子KLF₄对多个基因都具有调控作用,是否有其他机制参与KLF₄的抗癫痫作用需要进一步研究,同时我们测序发现的相关SNPs其生物学和临床价值仍需深入研究。