视紫红质基因克隆

生物技术综合实验（Ⅱ）论文
bop基因克隆
专业名称：生物技术
学生姓名：
学号：
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指导老师：金卫华
2016年12月
目录
生物技术综合实验（Ⅱ）论文 (1)
bop基因克隆 (1)
理论部分 (3)
摘要 (3)
关键词 (3)
引言 (4)
实验部分 (5)
实验材料 (5)
实验方法 (6)
结果与讨论 (13)
实验结果 (13)
实验讨论 (1)
理论部分
摘要
目的：通过选择克隆型载体pUC18为构建重组质粒的载体，质粒pUC19中的细菌视紫红质基因bop为目的基因，利用分子生物学相关技术构建pUC18－bop重组质粒，再将该重组质粒导入到大肠杆菌DH5α细胞中进行克隆，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，初步证实该实验是否实现了视紫红质目的基因（即bop基因）的克隆。

方法：用小量制备质粒DNA的方法分别提取克隆型质粒载体pUC18和含细菌视紫红质基因bop的质粒pUC19，分别用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ进行双酶切后,在紫外透视仪上取酶切后pUC18质粒和Bop基因，在T4连接酶作用下，16℃恒温水浴过夜连接，再将连接后的产物导入到制备好的感受态细胞，将转化后的产物接种到含氨苄青霉素（0.1g/ml）LB琼脂平板，37℃恒温培养箱培养过夜，最后，挑取单菌落经PCR扩增后，进行1％琼脂糖凝胶电泳筛选阳性单克隆。

结果：质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测后，初步断定已分离提纯出不含蛋白质、RNA、脂质等杂质PUC18、PUC19质粒。

酶切产物经电泳检测发现，PUC18只产生了一条荧光带，PUC19产生了两条荧光带，初步断定光带1是PUC18,光带2是Bop基因，可利用泳道②上的光带和泳道③上的光带1进行连接实验。

转化结果检测显示可直接从已形成菌落的平板中挑取单菌落进行PCR扩增实验。

最后，PCR 回收产物检测，两泳道中的光带都位于1000-2000之间，与预测的bop基因电泳所处位置相符，初步断定bop基因已成功转入到宿主细胞。

结论：构建pUC18－bop重组细菌视紫红质基因，经特异性PCR扩增鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，初步证实该实验实现了视紫红质目的基因（即bop基因）的克隆。

关键词
Bop基因、pUC18质粒、琼脂糖凝胶电泳、PCR聚合酶链反应
引言
视紫红质（BR）是一种含视黄醛的膜蛋白，它位于动物视觉器官的感光细胞中，接受光讯号转变为电讯号。

细菌视紫红质基因（简称bop 基因)是编码盐沼盐杆菌紫膜中细菌视紫红质分子的一段DNA 序列。

BR蛋白是一个光驱动质子泵，在光照条件下能将质子从膜内传递到膜外，产生跨膜的质子梯度，将光能转变为电化学势能，从而提供生命活动所需之能量。

它可以作为研究细胞膜受体蛋白的模型，有助于阐明药物与人体细胞靶受体以及信号传导途径中的受体与信号的相互作用机制；它的光驱动质子泵功能可应用在光电转换器，信号储存和光学检测等很多方面；随着生物化学、生物物理学和光学等学科的发展，BR的光致变色及光电响应特性在太阳能电池、人工视网膜、光信息存储、神经网络、生物芯片等应用领域具有广泛的应用前景，自从上世纪60年代末人们从嗜盐菌中发现BR以来，BR 已成为研究得最热和最透彻的膜蛋白之一。

实验部分
实验材料
1.菌种
大肠杆菌DH5a(含PUC18质粒及重组质粒的两种菌)
2.试剂
氨苄青霉素、75%酒精、异丙醇、TAE电泳缓冲液、RNA酶、酚氯仿（酚与氯仿体积比为1:1）、氯仿、溴化乙锭（EB）、琼脂糖、无菌水、10xBuffer、溴酚蓝指示剂、 T4 连接酶、10×T4 连接酶 Buffer、
碱裂解液Ⅰ：PH8.0GET缓冲液（50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA,25mmol/LTrisHCL）碱裂解液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(内含10%的SDS),用的时候需现配
碱裂解液Ⅲ：PH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）LB培养基：蛋白胨1g、氯化钠1g、酵母提取物0.5g、蒸馏水100ml（固体培养基中加入 1.2g琼脂粉）
3.仪器
电子天平（上海横平仪器仪表厂，型号JY2002）、万用电炉（北京市永光明医疗仪器厂，型号DL-1）、小型号台式离心机（编号：00011579）、恒温水箱、电热恒温鼓风干燥箱（编号：00011544）、稳压稳流电泳仪（编号：00011659）、美的冰箱（编号：00007418）、摇床（编号：13001698）、梯度PCR仪（编号：00012228）、医用型净化工作台（编号：00011624）、全自动灭菌锅（编号：13001693）、数显恒温智能生化培养箱（编号：13001697）、
实验方法
1.菌种活化
1)LB培养基的配置
称取蛋白胨1g、氯化钠1g、酵母提取物0.5g放于烧杯中，加适量蒸馏水搅拌溶化并定容至100ml。

完全溶解后，分装到两个三角瓶中，每个三角瓶中各50ml。

向其中一个三角瓶中加入1.2g琼脂粉后，塞上棉塞，并用报纸和棉线扎紧瓶口。

2)灭菌
将枪头、50mlLB固体培养基、50mlLB液体培养基、装有牙签的培养皿、10支试管、四个培养皿放入灭菌锅121℃灭菌20min
3)无菌接种
在无菌操作台中，取出LB固体培养基，待其温度降至50℃左右（不烫手）,加入50μL氨苄青霉素.混匀后，倒三个平板。

培养基凝固后，分别划线接种含PUC18 、PUC19质粒的大肠杆菌菌种，编号1、2。

平板倒置放在37℃培养箱中培养过夜。

4)挑单菌落
在无菌操作台中，取出LB液体培养基，待其温度降至50℃左右（不烫手）,加入50μL氨苄青霉素.充分混匀后，分装于10支试管中，每支试管各5ml。

用镊子取无菌牙签挑取1、2平板上的单菌落，接种于于5ml LB含氨卞青霉素（0.1g/ml）的液体培养基内，37℃恒温摇床振荡增殖培养过夜。

2.碱裂解法制备质粒
1)细菌收集
用微量移液枪各取1.5mL两种菌液至2ml EP管内做好标记，6 000 rpm离心3min，弃上清。

再次取样1.5mL菌液至同一EP管内，重复离心，弃上清。

2)细菌裂解
向上述沉淀中加入100μL冰预冷的碱裂解液Ⅰ，用微量移液枪吹打至菌悬液完全浑浊；加入200μL新配置的碱裂解液Ⅱ于菌悬液中，盖严管盖，轻轻颠倒混匀4-5次，但切勿振荡，冰浴约5min，至瓶盖下出现粘稠丝状物为止；再加入150μL预冷的溶液Ⅲ，盖严管盖，温和颠倒数次，冰浴5min。

3)提取质粒
10000rpm 室温离心5min，取上清至一个新的无菌的1.5mL EP管中，记住体积
4)质粒纯化
向上述上清中加入等体积酚氯仿混合物，盖紧管口，振荡混匀，10000rpm离心5min，将上清转入另一个EP管中；将酚氯仿的混合物换成等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，将上清转入另一个EP管中；向上述上清中加入等体积的异丙醇，轻微振荡后摇匀，室温静置15min；10000rpm离心10min，去上清，向EP管中加入70%乙醇，盖紧管口，颠倒几次以洗净沉淀，10 000rpm离心2min，弃去上清液，在50℃烘箱中烘干至沉淀变透明
5)纯化质粒DNA
将同种纯化质粒的两管混合，加入50μL蒸馏水，并加入2μL 的去除了DNA 酶的RNA酶，-20℃冰箱保存备用
3.质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测
1)配胶
称取琼脂糖0.35g放入三角瓶，加50ml电泳缓冲液，在电炉上充分加热溶解。

待琼脂糖凝胶稍冷后（微微烫手），向其中滴加一小滴EB（溴化乙锭）溶液，使溶胶成微红色，摇匀。

2)制胶
将琼脂糖凝胶溶液倒入电泳胶膜中，用微量移液枪吸去溶液中的气泡，选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端。

待胶体凝固后，垂直拔出梳子，将电泳胶放到电泳槽的平台上，加电泳缓冲液使其刚好浸没胶面。

3)加样
分别取2~3μL DNA样品与1μL含溴酚蓝指示剂的上样缓冲液均匀混合，混匀后用微量移液枪将样品小心加入加样孔内，同时取5μL DNA Marker上样，记录样品点样次序
4)电泳
盖上电泳槽盖，开启电源开关，调节电压至100V/cm，使DNA从负极向正极移动。

约需电泳20min。

5)紫外观察
切断电源，取出凝胶，置于紫外透视仪上观察实验结果并拍照。

4.PCR扩增目的基因
1)按下列次序，讲个成分加入PCR反应管：
H20 35μl
20mmol/L 4种DNTP混合物5μl
10xPCR buffer 2μl
20mmol/L正向引物2μl
20mmol/L反向引物2μl
1.2μl Taq DNA聚合酶2μl
模板DNA 2μl
总体积50μl
2)充分混匀后，将PCR反应管放置在PCR仪的加热板上
3)梯度PCR按下列条件扩增：先95℃预热5 min，再按如下参数循环30次：94℃
变性5min，55℃退火30 s，72℃延伸80s 。

最后，72℃保温10min.
4)将PCR产物置于—20℃冷藏保存
5.PCR产物电泳及回收纯化
1)称取0.5g琼脂糖放入三角瓶中，加入50mL电泳缓冲液，与电炉上加热溶解
2)待溶液稍冷后加入1小滴EB(溴化乙锭)溶液，使溶胶出现红色，摇匀
3)倒胶（无气泡），厚度为0.3cm左右（用于检测的凝胶不可太厚，否则观察效
果较差），放好大孔梳子和挡板
4)待胶完全凝固后，小心垂直取出梳子，将载有凝胶的电泳胶板放入电泳槽的平
台中，加入电泳缓冲液，使其刚浸没胶面。

5)将上次扩增的PCR产物合并，都放入一个PCR反应管中，再向管中直接加入
10μL的上样缓冲液（内含溴酚蓝指示剂），用移液器混匀后，将所有的PCR 产物上样，同时Mark也取相同体积上样
6)接通电源，使用100V恒压电泳
7)根据溴酚蓝指示剂的迁移位置，决定是否终止电泳（约20分钟）
8)切断电源，取出凝胶，放在紫外透视仪上观察实验结果并拍照
9)在紫外透视仪内，用解剖刀从凝胶上迅速割下1200bp的目的带（所割得的胶
越少越好），放入2mL的EP管中
10)向EP管中加入合适体积的溶胶液（浸过胶即可），55℃恒温水浴箱中水浴
10min(保证胶全部融化)
11)将EP管中溶液加入到吸附柱试剂盒中，12000r/min，；离心60s，倒掉废液
12)向吸附柱试剂盒中加入500μL漂洗液，12000r/min，；离心60s，倒掉废液
13)向吸附柱试剂盒中再次加入500μL漂洗液，12000r/min，；离心60s，倒掉废
液
14).将吸附柱试剂盒继续在12000r/min下，离心2min，打开吸附柱试剂盒的管
盖，在室温下放置2min，晾干
15)将吸附柱试剂盒转入到另一个干净的1.5mL离心管中，加入已预热至65℃的
洗脱缓冲液50μL，在室温下放置2min后，13000r/min，离心2min，收集吸附柱试剂盒中的DNA
16)－20℃冰箱中保存
6.质粒和目的基因PCR产物的酶切及纯化
1)在1.5ml离心管中依次加入以下成分：
无菌去离子水6μl
10×缓冲液2μl
质粒DNA(pUC18和PCR产物) 10μl
BamH Ⅰ 1μl
Hind Ⅲ 1μl
总体积20μl
2)混匀后，离心5s，37℃过夜
3)琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，电泳条件：100V，30~60min
注：为验证双酶切是否成功，可做如下对照：酶切反应时设置另外两管分别进行单酶切，看电泳后单酶切的两管是否成线性，如两管均成线性可初步判断双酶切成功。

7.感受态细胞的制备
1)大肠杆菌DH5α的接种活化和扩大培养
i.配置LB固体和液体培养基各50mL（步骤同菌种活化，培养基不加氨苄青
霉素）
ii.灭菌和倒平板（步骤同菌种活化，灭菌物品改为0.1mol/LCaCl2 、大中小号枪头各一盒、6个平皿、7支试管、一盒牙签、两支玻璃涂布棒）
iii.在无菌操作台中，从老师给的无氨苄青霉素抗性的大肠杆菌DH5α平板中分别挑取单菌落接种于2支LB液体培养基中
iv.放入37℃的恒温摇床中，过夜培养
2)氯化钙制备感受态细胞
i.将活化好的菌液于冰水混合物中放置10min，在无菌操作台中，取1mL菌
液于无菌的1.5mL的离心管中
ii.4℃，4000rmp离心5min,倒掉上清液
iii.在无菌操作台中，加入800μL冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 溶液（已灭菌），用移液器吹打悬浮菌体
iv.重复步骤ⅱ和ⅲ
v.4000rmp离心5min,倒掉上清液，在无菌操作台中，再加入100μL冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液（已灭菌），用移液器吹打悬浮菌体，于4℃放
置备用；
8.在质粒载体中进行外源DNA的克隆
1)在无菌1.5ml离心管中依次加入以下成分：
酶切后的pUC18质粒载体1μl
酶切外源基因片段 6μl
T4DNA连接酶（3U/μL） 0.5μl
10x T4DNA连接酶Buffer 1μl
无菌水 1.5μl
总体积10μl
2)放于16℃的恒温水浴箱中过夜
9.质粒DNA的转化
1)将实验6中已灭菌的LB固体培养基放在电炉上加热至完全融化，在无菌操
作台中，待固体培养基的温度降到50℃（不烫手）左右，向培养基中加入50μl氨苄青霉素溶液（0.1g/mL）并混匀，倒三个平板
2)用移液器取50μl的感受态DH5α菌液加到20μl的重组质粒DNA（DNA连
接物）中，混匀后，静置冰水浴10min，然后42℃静置水浴热激90s后，迅速放回冰水浴2－3min，再在无菌操作台中，用无菌涂布棒涂布于第一个平板上
3)同时，设立两个对照组，第二个平板用感受态细胞DH5α菌液直接涂布于
平板上；最后一个平板为空白对照
4)待菌液被琼脂吸收后，将平板倒置放于37℃恒温培养箱中，培养过夜，第
二天取出，观察结果
10.重组子的鉴定
1)在无菌操作台中，用已灭菌的牙签挑取转化平板上的单菌落，放入已灭菌的液
体LB培养基（已加氨苄青霉素溶液）中，共接种5支试管，均放于37℃恒温振荡箱中，培养过夜
2)选取大肠杆菌DH5α生长良好的试管，先从中取1mL菌液于离心管中，用SDS
碱裂解法提取重组质粒，再向该离心管中加入1mL菌液提取，平行做两管（参照上述实验）
3)按下表的次序，将各成分加入到PCR反应管中，PCR扩增目的基因；
PCR反应物：
H2O 18μL
10x PCR Buffer 2.5μl
20mmol/L4种dNTP混合液0.5μl
20μmol/L正向引物 0.5μl
20μmol/L反向引物0.5μl
模板DNA 2.0μl
TaqDNA聚合酶 1.0μl
总体积25μl
加完后，离心混匀30s左右，以上操作时要求在无菌条件下进行，各种试剂应置于冰上
4)将已加入所有样品的PCR反应管放入PCR反应仪的加热板上，按下列程序进
行PCR扩增
先95℃预热5 min，再按如下参数循环30次：94℃变性5min，55℃退火30 s，72℃延伸80s 。

最后，72℃保温10min.
5)用25 μl的PCR产物和21μl的重组质粒上3个样本，电泳鉴定（参照上述实
验）
11.重组质粒的酶切及鉴定
1)对重组质粒进行酶切（参照上述实验）
2)电泳鉴定重组质粒和酶切后质粒（参照上述实验）
结果与讨论
实验结果
1.第一次SDS碱裂解法提pUC18载体
第一次SDS碱裂解法提取pUC18质粒后，电泳鉴定时，发现泳道2和6上只得到一条不成带形的“脱尾”亮带，且对应的碱基数位置在100～750bp之间，推测得到的这段亮带是被打断的不完整质粒
1 2 3 4 5 6 7 8
bp
2000
1000
750
500
250
泳道1 marker，2~8 pUC18质粒
2.第二次SDS碱裂解法提pUC18载
体
第二次SDS碱裂解法提取pUC18质粒后，电泳鉴定时，发现泳道2~4上只得到一条亮带，且对应的碱基数位置在1.9kb左右，与预测的闭合环状的pUC18质粒电泳所处位置相符
1 2 3 4
bp
2000
1000
750
500
250
100
泳道1 marker
泳道2~4 pUC18质粒3.PCR扩增目的基因及鉴定
对老师提供的携带bop目的基因的pUC19质粒载体进行PCR扩增，电泳后发现，泳道2~5上只得到一条清晰的亮带，亮度较大，带形较宽且连续，且对应的碱基数位置在1.2kb左右，与预测的PCR扩增产物电泳所处位置相符；在泳道2~5上的目的条带下方，出现了模糊的涂抹带；在对应的碱基数位置为110bp左右，出现了一条模糊带
1 2 3 4 5
bp
2000
1000
750
500
250
100
泳道1 marker
泳道2~5 PCR产物
4. 酶切pUC18载体和目的基因及鉴
定
经限制性内切酶 BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ处理后，电泳发现,泳道2和3得到几条清晰的亮带，且对应的碱基数位置在2.1kb 处亮带特别明显
1 2 3 bp 2000 1000 750 500 250 100
泳道1 marker
泳道2、3 酶切后pUC18质粒及产物
5. 酶切法鉴定重组子
1 2 3 4 5 6 7 bp
2000 1000 750
500 250 100
泳道1 marker
泳道2~7 酶切后开环的pUC18质粒
实验讨论
本次试验以pUC18质粒为载体，pUC19－bop质粒为目的基因供体，通过PCR扩增出含目的基因(bop)的特异性DNA片段,将克隆载体pUC18及目的基因经限制性内切酶BamH I和HindⅢ双酶切后，在T4 DNA连接酶连接下，形成重组质粒并转化入大肠杆菌DH5α。

通过氨苄青霉素平板筛选出抗性转化子,对重组子进行PCR和酶切，经电泳鉴定检测发现构建成功，完成了pUC18－bop重组质粒的构建,为后续进一步对bop基因的实验研究奠定了基础。

本试验包括了菌种的活化和扩大培养、pUC18质粒的提取、PCR特异性扩增bop 基因、感受态细胞的制备、载体和目的片段的酶切及连接, 重组子的转化, 转化子的抗性筛选, 重组子的鉴定等步骤。

通过查阅Genbank可知，pUC18质粒的碱基数为2686bp，在本次实验中，所用的限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ的碱基位点在pUC18质粒上相隔30bp，而导入的是bop基因及其启动子基因片段，所以可推测出pUC18-bop重组质粒的碱基数在3852bp左右。

在琼脂糖凝胶电泳中，共价闭合环状pUC18质粒是电泳速度最快的，线性pUC18质粒居中，开环pUC18质粒最慢，通过本次实验pUC18质粒电泳带和酶切后pUC18质粒电泳带比较，可证实这一点。

总之，我们通过大肠杆菌DH5α细胞所克隆得到的重组质粒，初步确认就是导入了视紫红质目的基因的pUC18质粒；有关视紫红质目的基因的性状表达，应做进一步的实验鉴定
参考文献：
[1] 周然，苏明学，刘爽．“基因工程的基本操作程序”．生物学通报，2013年第48卷第9期
[2] 周鹏．Halobiforma sp.AJ5 bop基因克隆与表达和嗜盐古菌基因组进化分析．博士学位论文，2008．02．01
[3] 齐静．pUC18质粒DNA特殊拓扑结构实体的研究．硕士学位论文，2002．3．20
[4] 陈洪栋．一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧．生物技术通报，2009年增刊。