microRNA-130a在慢性粒细胞白血病细胞耐药中的作用

microRNA-130a在慢性粒细胞白血病细胞耐药中的作用苏梅芳
【摘要】目的比较microRNA-130a在伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病(CML)细胞株K562R和伊马替尼敏感的CML细胞株K562中的表达,探讨其与CML细胞耐药的关系.方法通过实时荧光定量PCR检测耐药株K562R和敏感株K562中microRNA-130a的表达水平.通过电穿孔转染法将microRNA-130a模拟物mimic转入敏感株K562中上调microRNA-130a的表达,分别用伊马替尼处理转染mimic细胞株及对照siRNA细胞株,记录各组细胞增殖情况.通过AnnexinV和PI双染法分别检测各组细胞凋亡情况.使用不同浓度的伊马替尼处理转染mimic细胞株及对照细胞株,利用MTT法检测各组细胞对伊马替尼的敏感性.结果microRNA-130a在耐药株K562中的表达明显高于敏感株K562.转染microRNA-130a模拟物mimic的K562细胞对伊马替尼的增殖抑制率明显低于对照组,凋亡情况也明显少于对照组.使用不同浓度的伊马替尼处理转染mimic细胞株及对照细胞株,mimic组细胞增殖抑制率明显低于对照组,IC50分别为0.13
μmol/L和3.19 μmol/L.结论 microRNA-130a在伊马替尼耐药株K562R中呈高表达,上调microRNA-130a的表达可降低K562对伊马替尼的敏感性.%Objective To compare the expression of microRNA-130a in imatinib-resistant K562R cells and imatinib-sensitive K562 cells,and to investigate the relationship between microRNA-130a and drug resistance of chronic myeloid leukemia (CML).Methods The expression of microRNA-130a in imatinib-resistant
K562R cells and imatinib-sensitive K562 cells was detected by real-time RT PCR.MicroPNA-130a mimic was transferred into K562 cells by electro-transfection.K562/mimic and the control cells were treated with
imatinib,then the cell proliferation was recorded and apoptosis was detected by flow cytometry with AnuexinV/ PI staining.MTT method was used to detect the proliferation ability of K562/mimic and the control cells treated with imatinib.Results The expression level of microRNA-130a in imatinib-resistant K562R cells was higher than that of imatinib-sensitive
K562 cells.The proliferation inhibition rate to imatinib and the apoptosis rate of K562/mimic were lower than those of control cells,and the IC50 was 0.13 μmol/L and 3.19 μmol/L respectively.Conclusion MicroRNA-130a is highly expressed in imatinib-resistant K562R cells,and up-regulating the expression of microRNA-130a can decrease the sensitivity of imatinib to CML.
【期刊名称】《实用药物与临床》
【年(卷),期】2017(020)008
【总页数】4页(P879-882)
【关键词】慢性粒细胞白血病;microRNA-130a;伊马替尼;耐药
【作者】苏梅芳
【作者单位】黄冈市中心医院,武汉黄冈430000
【正文语种】中文
慢性粒细胞白血病(CML)是一类造血干祖细胞异常增生的恶性克隆性疾病。

该类疾病的一个重要特征是染色体t(9;22) (q34;q11)异位形成费城染色体[1]。

费城染色体的形成导致融合蛋白BCR-ABL异常高表达。

融合蛋白BCR-ABL具有很强的酪
氨酸激酶活性，激活其下游多条信号通路，使细胞获得无限增殖的能力。

这也是慢性粒细胞性白血病的主要发病原因[2-3]。

伊马替尼特异性针对BCR-ABL等酪氨酸激酶抑制剂，临床主要用于CML的治疗。

但长期服用伊马替尼，患者易产生耐药性，严重影响伊马替尼的临床疗效[4]。

microRNA是一类长度为18～24 nt的小非编码RNA，通过与目标RNA 3′UTR的结合而抑制靶基因的表达[5]。

microRNA在细胞增殖、分化、凋亡等多种生命活动中发挥重要作用[6]。

近年研究发现，microRNA的特异性表达或沉默与CML的发生及耐药性相关[7-10]。

本研究观察microRNA-130a在伊马替尼耐药细胞株K562中的表达，探讨其与CML细胞耐药的关系，以期为临床伊马替尼的耐药提供理论基础。

1.1 细胞来源伊马替尼耐药株K562R和敏感株K562购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 试剂和仪器反转录试剂AMV逆转录酶购于Takara公司，SYBR荧光定量试剂盒购于罗氏公司，AnnexinV和PI凋亡检测试剂盒购于北京全式金生物公司，MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购于碧云天公司。

二氧化碳细胞培养箱购于Thermo公司，实时定量PCR检测仪购于美国ABI公司，流式细胞仪FACSCalibur购于美国B&D公司。

1.3 细胞培养耐药株K562R和敏感株K562用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基培养，培养于37 ℃的含5% CO2、95%空气的培养箱中。

1.4 RNA抽提、反转及实时定量PCR检测离心收集细胞，采用Trizol法抽提RNA，并对抽提的RNA进行定量。

使用AMV逆转录酶将抽提的RNA反转录为cDNA。

反转录的cDNA作为模板进行实时定量PCR检测。

实时定量PCR特异性检测microRNA-130a引物由上海生工生物公司合成，序列如表1所示。

PCR反应体系为：2×SYBR Mix：5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.2 μL，模板cDNA 25 ng，无菌水补至10 μL。

反应条件为95 ℃ 1 min，95 ℃
变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循环数为40，每个循环进行一次荧光信号的收集。

microRNA-130a的相对表达量采用2-ΔΔt对基因表达量进行相
对定量。

1.5 microRNA-130a mimic和对照无义链siRNA的合成设计特异性的microRNA-130a mimic序列和对照无义链siRNA序列，所设计核苷酸序列由上
海生工生物公司合成。

microRNA-130a mimic和对照无义链siRNA序列如表1
所示。

1.6 microRNA-130a mimic转染收集处于对数生长期的K562细胞2×107个，无血清PRIM-1640重悬，使细胞浓度为2×106/mL，将细胞等分至2个电转杯中，一个电转杯加入对照链siRNA，另一个电转杯加入mimic，冰上放置15 min，设定电压为250 V，转染浓度为100 nmol/L进行转染。

转染后继续培养，培养
24 h后，实时定量PCR检测mimic表达情况。

1.7 细胞增殖曲线分别将转染siRNA和mimic K562细胞培养于六孔板中，每孔
细胞数为1×106，每组设3个副孔，3 μmol/L伊马替尼处理各孔细胞，隔天收集细胞，记录细胞数，绘制细胞增殖曲线。

1.8 AnnexinV和PI凋亡检测、MTT检测细胞增殖抑制率分别收集经3 μmol/L
伊马替尼处理后的转染siRNA和mimic的K562细胞，按AnnexinV和PI凋亡
试剂盒步骤对细胞进行AnnexinV和PI标记，流式仪检测AnnexinV和PI标记的细胞，分析细胞凋亡情况。

分别将转染siRNA和mimic的K562细胞培养于96孔板中，每孔细胞数为
3×104，按0、1、5、10 μmol/L的伊马替尼分别处理两组细胞，置于37 ℃培养，培养48 h。

终止培养前4 h每孔分别加入20 μL MTT试剂，培养48 h后，离心
弃上清，加入150 μL DMSO，充分涡旋振荡混匀，全自动酶标仪检测570 nm波长处的吸光值。

计算各组细胞增殖抑制率，根据线性回归方程求得伊马替尼作用于
siRNA和mimic的 K562细胞的半数抑制浓度IC50。

1.9 统计学分析收集的实验数据采用SPSS 13.0软件进行统计处理，计量资料以
±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 K562和K562R细胞中microRNA-130a的表达实时定量PCR检测结果表明，与敏感株K562相比，microRNA-130a在耐药株K562R细胞中的表达水平显著
提高(P<0.01)，表达水平为K562的(5.19±0.57)倍。

见图1。

2.2 microRNA-130a mimic和siRNA转染K562后microRNA-130a的表达实时定量PCR检测结果表明，K562转染microRNA-130a mimic后，细胞总microRNA-130a的表达水平较对照组明显增高(P<0.01)，表达水平为K562 siRNA的(26.72±
3.06)倍。

见图2。

2.3 microRNA-130a mimic和siRNA转染K562后细胞增殖情况 K562转染microRNA-130a mimic和siRNA后，分别取等量的细胞进行培养，同时伊马替
尼处理各组别细胞，分别在第0、2、4、6天测定两组细胞的细胞数，绘制增殖曲线。

增殖曲线结果表明，伊马替尼处理对两组细胞增殖抑制作用明显，mimic组
细胞增殖抑制情况好于siRNA组(P<0.05)。

见图3。

2.4 microRNA-130a mimic和siRNA转染K562后细胞凋亡情况 K562转染microRNA-130a mimic和siRNA后，分别取等量的细胞进行培养，同时伊马替
尼处理各组别细胞，24 h后检测各组细胞凋亡情况。

流式结果表明，伊马替尼处
理后，两组细胞均表现出明显的凋亡现象。

siRNA组凋亡细胞约占66.3%±5.62%，mimic组凋亡细胞约占32.4%±2.15%。

两组细胞凋亡情况比较差异有统计学意义(P<0.01)。

见图4。

2.5 MTT法检测microRNA-130a mimic和siRNA转染的K562细胞对伊马替尼的敏感性 K562转染microRNA-130a mimic和siRNA后，分别取等量的细胞进行培养，同时用0、1、5、10 μmol/L伊马替尼处理各组别细胞，MTT法检测
microRNA-130a mimic和siRNA转染的K562细胞对伊马替尼的敏感性。

MTT
结果显示，随着药物增加，伊马替尼对mimic和siRNA两组细胞的增殖抑制作用呈递增趋势。

但是mimic细胞达到相同抑制率所需要的伊马替尼的浓度明显高于siRNA细胞。

伊马替尼对siRNA和mimic K562的半数抑制浓度IC50分别为
0.13、3.19 μmol/L，两组细胞IC50比较差异有统计学意义(P<0.01)。

见图5。

伊马替尼作为治疗慢性粒细胞白血病常用的酪氨酸激酶抑制剂，多数患者在用药初期对药物敏感，但治疗后一段时间往往产生耐药性[11-15]。

近年来，越来越多的
研究开始关注microRNA在白血病发生、发展及耐药中的作用。

最近研究表明，microRNA异常表达与酪氨酸激酶抑制剂的耐药性相关[16]。

近年来研究报道，在多种肿瘤组织(如卵巢癌[17]、肺癌[18]和胃癌[19-20])中，microRNA-130a表达明显上调。

伊马替尼作为酪氨酸激酶抑制剂，开启了白血病分子靶向治疗的新纪元。

本研究发现，伊马替尼耐药株K562R细胞中，microRNA-130a表达较敏感株K562明显
上调，提示microRNA-130a在CML细胞中表达，并且其表达水平可能与伊马替尼的敏感性有关。

为此，笔者在敏感株K562细胞中过表达microRNA-130a的
类似物mimic，转染mimic的K562细胞microRNA-130a相对表达量明显高于对照组。

结果表明，外源microRNA-130a的类似物mimic在敏感株K562中过
表达成功。

为了进一步明确microRNA-130a如何调控CML对伊马替尼的敏感性，本研究分别检测了转染mimic和siRNA的K562细胞的增殖情况。

伊马替尼对过表达microRNA-130a的K562细胞抑制作用明显减弱，表明microRNA-130a
明显加速了K562对伊马替尼的耐药性。

通过流式分析检测细胞凋亡情况，经伊马替尼处理后，过表达microRNA-130a的K562细胞凋亡情况明显改善。

流式分
析检测提示，过表达microRNA-130a通过抵抗凋亡进而降低白血病细胞对伊马
替尼的敏感性。

进一步耐药实验结果表明，过表达microRNA-130a的K562的
IC50从0.13 μmol/L提升至3.19 μmol/L，过表达microRNA-130a后，白血病细胞对伊马替尼更不敏感。

microRNA-130a表达上调可减弱K562细胞对伊马替尼的敏感性，增强其耐药能力，其耐药能力的增强可能与细胞的凋亡相关，但具体的作用机制有待进一步研究。

microRNA-130a作为抑癌基因，对CML的耐药性及敏感性有重要意义。

microRNA-130a在伊马替尼敏感和耐药的患者中的差异表达，可作为临床上伊马替尼的治疗依据，并且为个体化治疗提供了潜在的治疗靶点。

今后的研究应深入探讨microRNA-130a在CML耐药中的具体机制，以期为临床实践提供基础资料，为白血病耐药防治提供新的作用靶点。

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