人血管平滑肌细胞的原代培养及其钙化模型的建立

[作者简介] 程孝中,男,安徽大学生命科学学院在读硕士研究生,主要从事细胞生物学研究
[作者单位] 1.安徽大学生命科学学院,合肥 230039;2.军事医学科学院生物工程研究所,北京 100850
[通讯作者] 钟 辉,Te:l 010-********,E-m ai:l t ow all @yahoo .
co m;黄 蓓,E-m ai:l b ei huang @163.co m
#安徽大学生命科学学院和军事医学科学院生物工程研究所共同为第一单位
人血管平滑肌细胞的原代培养及其钙化模型的建立
程孝中
1,2#
,宋 婷2,黄 蓓1,钟 辉
2
[摘要] 目的 利用B -甘油磷酸盐处理人血管平滑肌细胞(hu m an vascu l ar s m ooth m uscle ce lls ,HV S M Cs )制备体外血管钙化模型。

方法 用组织贴壁法从人胚胎脐带动脉中分离原代人主动脉平滑肌细胞,原代细胞通过抗体A -s m-ac tin 染色鉴定,将传4~6代的细胞分为钙化组和对照组,对照组用正常D M EM 培养基培养,钙化组加入10mm o l/L B -甘油磷酸盐诱导细胞钙化,连续培养10d 。

茜素红S 染色及碱性磷酸酶法鉴定。

结果:分离的原代细胞经S -P 染色鉴定为阳性,呈淡黄色。

钙化组细胞诱导钙化后,细胞增殖缓慢,并形成囊泡结构,茜素红S 染色形成红色的钙化结节,钙化组碱性磷酸酶活性较对照组在不同时间点(4,6,8,10d)都有所增加(P <0.01)。

结论:B -甘油磷酸盐体外能够诱导HV S M C 钙化,此方法诱导的钙化模型是一种良好的研究血管疾病方面的体外模型。

[关键词] 人胚胎血管平滑肌细胞;原代培养;钙化模型[中图分类号] R 543.5
[文献标志码] A
[文章编号] 1000-5501(2010)01-0037-03
P ri m ary culture of hu m an vascular s m oot h muscle cells and their calcification m ode
C HE NG X iao -zhong
1,2#
,SONG Ting 2,H UANG Bei 1*,Z HONG H ui
2*
(1.L ife Sc i ence D epa rt m en t o f Anhu i U niversity ,H efe i 230039,Ch i na ;2.Be ijing Institute of B i o techno l ogy ,Be iji ng
100850,Ch i na)
*C orres ponding au t hor ,Z HONG H u,i Te:l 010-********,E-m ai:l t owa l @l yahoo .co m;HUANG B e,i E -ma i :l bei huang @163.co m
[Abstract] Ob jective T o establi sh a calc ificati on m ode i n vitro of hu m an vascular s mooth m uscle cells (HV S M C s)in -
duced by B -GP.M ethod s P ri m ary HVS M Cs were obta i ned from hu m an embryo by p l antm et hod and confir m ed by sta i n w ith A -s m -ac tin anti body .T he ce lls after 4-6passagesw ere div i ded i nto t w o groups .The control group w as i ncubated w ith no r ma l DM E M m ed i u m w hile the ca l c ifi cati on g roup w as i ncubated w ith t he m ed i u m containi ng 10mm o l/L B -g l ycerophospha te f o r 10days .Ca lcifica tion w as confir m ed by a lizar i n red S stai n and a l kali ne phosphatase(ALP)assay s .Resu lts T he pr i m ary ce lls observed by S -P sta i n we re positi ve and the ce lls a fter be i ng stained w ere pa l e ye llo w.A fter be i ng i nduced w it h B -G P ,the ce lls of ca lcificati on g roup began concen tric gro w th and for m ed vesic l es .A lizar i n red S sta i n i ng s howed tha t the reaction o f ca lcify i ng nodu les was red ,A LP ac tiv ity w as h i gher than tha t of controls at var i ous ti m e po i nts(4d ,6d ,8d and 10d ,P <0.01).Con clusi on The HV S M Cs cou l d be i nduced i nto ca lcificati on in vitro by B -G P ,and this model contr i ba tes t o fur -t her stud i es o f vascular diseases .
[K ey words] hu m an e m bryo vascu l ar s m ooth m uscle ce lls ;pri m ary cu lt u re ;calc ificati on mode 随着年龄的增长,多数老年人的主动脉都存在着渐进的钙盐沉积,即动脉钙化,其最终会导致高血压、动脉粥样硬化等血管疾病[1~3]。

而血管平滑肌细胞(vascu l a r s moo t h m us -cle cells ,V S M Cs)是动脉发生钙化的主要细胞,VS M C s 体外诱导钙化是研究心血管疾病发病机制的重要细胞模型。

目
前,V S M Cs 的体外原代培养主要来源于大鼠,本研究对分离自人胚胎组织的人V S M Cs(HVM Cs)进行体外原代培养,并经B -G P 诱导形成钙化,旨在为研究心血管疾病发病机制提供更准确的细胞模型。

1 材料与方法
1.1 材料
人胚胎(胎龄32周),解放军总医院提供;DM E M 培养基购自G i bco 公司;小牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司;B -磷酸甘油酯(B -GP )、茜素红购自北京欣经科生物技术有限公司;羊抗A -S M-acti n(带HR P 标签)购自Santa Cruz 公司;碱性磷酸酶检测试剂盒购自南京建成生物工程公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2方法
1.2.1HVS M Cs的分离培养及其纯化取离体2h的胚胎,无菌操作取出胸主动脉,用D-H anks液反复冲洗,去除残留血液,小心剥去外膜,将主动脉放入DM E M液(含4.5g/L 葡萄糖,10mm o l/L丙酮酸,2mm o l/L谷氨酰胺,100U/L的青霉素及链霉素,20%加强型小牛血清)中,用眼科剪纵行剪开主动脉,用刀片轻刮内膜2~3遍以去除内膜,然后将主动脉剪成约1mm@1mm小块,用吸管吸取小块植入培养瓶底,小块间相距约0.5c m为宜,轻轻翻转培养瓶使瓶底朝上,置于37e、5%CO
2
细胞培养箱中静置4~5h使小块微干涸,然后加入少许培养基,静置于培养箱中5~6d后换液,待细胞长满培养瓶底面积80%后用0.25%的胰酶消化传代,传代2h后吸取上清液接种于另一培养瓶中,24h后根据细胞贴壁情况收取未贴壁细胞悬液,离心5m i n,重悬后接种到新的培养瓶中,反复多次差速贴壁法纯化细胞,实验用第5~8代细胞。

1.2.2细胞鉴定在六孔板内用消毒的盖玻片制作细胞爬片,待细胞贴壁生长至60%~70%融合时,弃去培养基,用1@PBS洗涤1~2次,爬片用95%乙醇固定30m in,1@PBS 洗2次,每次2m i n,加入抗体A-S M-acti n(1B100稀释), 37e孵育30m i n后滴加链亲和素生物素复合物(SABC), 37e孵育20m in,1@PBS洗4次,每次5m i n。

DAB显色,苏木素轻度复染,经分化,脱水,透明,封片,在显微镜下观察。

1.2.3体外钙化模型的建立将第4~8代细胞分为正常组和钙化组,待细胞长至70%汇合时,正常组仍用正常DM E M (10%胎牛血清)培养,钙化组使用钙化培养基(含10mmo l/L B-GP)培养[4],每2d更换培养液,连续培养10d。

1.2.4碱性磷酸酶测定细胞弃去培养液,1@PBS洗细胞3次,每孔加入500L l0.1%T r iton X-100(0.9%N aC l制备),4e过夜,反复吹打使细胞破碎,收集于离心管中,1200 r/m i n离心3m in,收取上清,按碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒操作测定ALP活性。

1.2.5茜素红染色细胞弃培养液,1@PBS洗细胞3次,加入0.5m l4%多聚甲醛室温固定20m i n,然后用重蒸水洗3次,加入1m l1%茜素红室温孵育20m i n,吸去染液,用重蒸水洗4次,放置2~3m i n使重蒸水挥发,在倒置显微镜下观察。

1.2.6统计学处理定量资料用 x?s表示,采用S A S9.1.3统计软件进行统计分析。

本研究采用具有一个重复测量的两因素设计,用F检验对交互作用效应的平均值进行两两比较,P<0.01表示差异具有统计学意义。

2结果
2.1原代细胞培养
人主动脉植块贴壁5d后可见细胞从植块周边游离出来,细胞呈梭形生长,致密排列成束状,细胞传代后,未贴壁时细胞呈椭圆型,不透明,4~6h后开始贴壁,贴壁后的细胞逐渐伸展,透明度增加,相互重叠生长,呈典型的峰谷形状(图1)。

图1分离自人胚胎主动脉的原代HVS MC s(@7)
2.2细胞鉴定
运用S-P免疫组化染色纯化后的平滑肌细胞,胞浆呈棕黄色,胞核蓝染(图2)。

图2经S-P染色的HV S M Cs(@7)
2.3碱性磷酸酶活性检测
碱性磷酸酶活性测定结果显示,对照组与实验组平均值之间的差异有统计学意义,F=7162.29,P<0.0001;6个时间点平均值之间的差异有统计学意义,F=2238.53,P< 0.0001;组别与时间交互作用项平均值之间的差异有统计学意义,F=1928.23,P<0.0001。

除0,2d外,其余各时间点对照组与实验组比较差异均有统计学意义,对应的t值分别为:-0.47,-0.39,-2.34,-33.86,-61.02,-109.22;P 值分别为0.6416,0.6985,0.0277,<0.0001,<0.0001, <0.0001。

因此,在4,6,8,10d实验组平滑肌细胞表达ALP 的活性强于对照组(表1)。

表1钙化组和非钙化组血管平滑肌细胞在不同时间点ALP值(
x?s,n=3)
组别
ALP(U/100m l)
时间(t/d)0246810
实验组11.42?0.1511.82?0.2012.96?0.11**25.23?0.29**35.97?0.43**54.57?0.45**对照组11.24?0.1011.67?0.2912.06?0.1012.38?0.1312.82?0.1313.13?0.41 **P<0.01,与对照组比较
2.4 钙化染色结果
茜素红染色结果显示,钙化组细胞呈橘红色,并分布于整个细胞,而对照组细胞没有附着红色染料(图3),表明钙化组细胞在钙化培养基条件下有大量的钙盐沉积,HVS M C
钙化模型成功建立。

图3 HVS MC s 钙化后茜素红染色结果(@15)
A.对照组;B .钙化组
3 讨论
最新研究发现,钙化形成的早期过程是一个与骨发育相似的可预防和可逆转的生物学过程[5],钙化发生的中心环节是V S M Cs 向成骨样细胞的转分化,V S M Cs 在诱导条件下(如炎性因子、TGF-B 、1,25-二羟化胆固醇和高密度脂蛋白等)均可转变为具有合成和分泌功能的成骨细胞,能合成和分泌多种骨形成蛋白,从而发生钙化
[2]。

以往体外研究都是采用鼠或者牛的平滑肌细胞
[6]
,本研
究在体外分离人胚胎主动脉血管平滑肌细胞进行原代培养并建立钙化模型,在临床上具有重要意义,所建立的体外HV S M Cs 钙化模型在研究人类血管疾病方面,比大鼠平滑肌细胞等钙化模型更为可靠。

在细胞培养过程中,我们采用差速贴壁法和组织块法获得了HVS M C ,有效降低了成纤维细胞和血管内皮细胞的数量。

而细胞纯度是钙化是否成功的关键,差速贴壁法保证了实验所用细胞的纯度,有利于钙化模型的成功建立。

此外,血管平滑肌细胞的鉴定采用目前常用的A -S M-acti n 抗体,经免疫组化染色后,纯化的血管平滑肌细胞A -S M-acti n
呈阳性,这表明分离纯化的细胞具有平滑肌细胞的特征。

体外诱导钙化模型建立的经典药物为B -GP,不同的文献中还配以维生素C 、胰岛素或者地塞米松联合诱导体外细胞钙化模型,我们单用B -G P 来诱导钙化,其效果依然明显,因为平滑肌细胞钙化时,细胞内的ALP 表达上升,B -GP 为A LP 的一种作用底物,在ALP 作用下分解产生无机磷酸盐,磷酸盐以囊泡形式分泌到胞外,与胞外基质相互作用,并形成钙化点。

此外,本研究对钙化的鉴定采用了常用的钙化染色及碱性磷酸酶测定。

其中钙化结节的鉴定采用茜素红染色[7],茜素红能够螯合钙盐,并呈现橘红色,比传统的染色方法(von K ossa)更敏感。

血管钙化是一个复杂的过程,对其发生和相关调节机制尚不是十分清楚,仍需进一步研究。

=参考文献>
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