山东省猪瘟E^rns基因系统进化分析与表达模式的研究

山东省猪瘟E rns
基因系统进化分析
与表达模式的研究
兰邹然1,张㊀月1,楚遵锋1,徐淑华1,田夫林1,王金宝2
(1.山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;2.山东省农业厅,山东济南250002)
㊀㊀摘要:采用RT -PCR 方法从山东省采集的怀疑携带猪瘟病毒(CSFV)的病料组织中扩增出全长为696bp 囊膜糖蛋白
E rns cDNA,其编码232个氨基酸的蛋白质,命名为SDCQ㊂通过构建E rns 蛋白家族系统进化树分析可知,山东省内流行的CS-FV 毒株与传统强毒株和疫苗用毒株在主要抗原编码基因上存在较大差异㊂将阳性重组表达质粒pPIC9K /E rns 电转化GS115酵母菌,经筛选㊁鉴定㊁甲醇诱导表达,SDS-PAGE 电泳分析,在培养液上清中检测到了目的蛋白E rns ,大约50kDa㊂Western
Blot 显示,E rns 是以同源二聚体的形式存在,且表达产物可以特异性识别CSFV 抗体㊂
关键词:猪瘟;E rns 基因;进化树;表达
中图分类号:S852.65+1㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:05296005(2019)04000705
㊀㊀
Phylogenetic analysis and expression of the E rns gene of classical swine fever
virus from the Shandong Province of eastern China
LAN Zou-ran 1,ZHANG Yue 1,CHU Zun-feng 1,XU Shu-hua 1,TIAN Fu-lin 1,WANG Jin-bao 2
Abstract :The envelope glycoprotein region,E rns of the classical swine fever virus (CSFV)was amplified by RT -PCR and se-
quenced directly from the sample collected from the Shandong province.Phylogenetic comparisons with 36reference strains based on the nucleotide sequencing resulted into a phylogenetic tree clustered into two groups of approximately equal sizes.The Shandong strain,designated as SDCQ,did not cluster with other major reference strains from China and outside.SDS -PAGE profiling yielded
a single protein band of ~50kDa.Dimerization of the purified E rns protein was present and was further confirmed by Western blot-ting.
Key words :Classical swine fever virus ;E rns gene ;phylogenetics ;expression.Corresponding author :TIAN Fu-lin
收稿日期:20171213
基金项目:山东省优秀青年科学家科研奖励基金资助项目(BS2010NY020)
作者简介:兰邹然(1970-),男,博士,从事动物疫病预防与控制工作,E-mail:lanzrjn@
通讯作者:田夫林,E-mail:fulin-tian@
㊀㊀猪瘟(CSF)为黄病毒科瘟病毒属成员,是严重危害养猪业的传染病之一,传染性很强,致死率较高,给养猪业造成巨大的经济损失,世界动物卫生组织(OIE)将此病列为A 类传染病之一[1]㊂世界上,包括亚洲㊁欧洲㊁中南美洲㊁部分非洲等许多国家采取了大规模的疫苗防控跟净化措施,但是猪瘟仍然普遍存在[2]㊂20世纪20年代我国首次对该病进行了报道,此后的几十年里,疫情接连不断的发生㊂1954年,Zhou 等[3]研发的猪瘟兔化弱毒疫苗虽然较好地控制了猪瘟在我国的广泛流行,但20
世纪70年代末,我国包括山东省等多个省份仍就受到该病的危害㊂
猪瘟病毒为单股正链RNA 病毒,基因组大约
12.5kb,由一个大的ORF 编码一个3898个氨基酸的多聚蛋白㊂该蛋白在细胞内蛋白酶和病毒特异性的蛋白酶作用下裂解成各种成熟的结构蛋白(S)和非结构蛋白(NS)㊂从N 端开始至C 端各蛋白质分别是N pro ㊁C㊁E rns ㊁E1㊁E2㊁p7㊁NS2㊁NS3㊁NS4A㊁
NS4B㊁NS5A 和NS5B㊂其中,E rns 和E2是其主要的保护性抗原,且E rns 具有RNase 酶活性,成为研究抗猪瘟病毒药物重要的靶基因[4]㊂
全球猪瘟流行性病学调查对研究猪瘟病毒的起源与消灭起很大的作用㊂过去,多数研究是针对E2基因㊂台湾的猪瘟的流行性病学调查指明E rns 和E2具有相似的系统进化树,且E rns 比E2在进化
上更保守些[5]㊂本研究就是想通过对E rns 的研究,
进一步揭示山东省猪瘟病毒在中国以及全球猪瘟病毒系统进化中地位㊂
1　材料与方法
1.1㊀菌种及质粒㊀E.coli Top10,购自生工生物工程(上海)股份有限公司;P.pastoris GS115和P.pastoris整合型分泌达质粒pPIC9K由山东省农业科学院家禽研究所赠送㊂
1.2㊀试剂与工具酶㊀酵母完全培养基(YPD)㊁选择培养基(MD)㊁甲醇选择培养基(MM)㊁诱导培养基(BMGY)和甲醇诱导培养基(BMMY)按Invitro-gen公司说明书配制;Plasmid Miniprep kit和Agar-ose Gel DNA Purification Kit Ver.
2.0以及各种限制性内切酶EcoRⅠ㊁NotⅠ㊁SalⅠ和T4DNA连接酶Ex taq酶,购自TaKaRa公司;Tryptone Yeast为OX-OID产品;YNB为Solarbio产品㊂
DL-2000DNA Marker㊁低分子质量蛋白质Marker,购自TaKaRa公司;四甲基氨基甲烷(TEMED)D-山梨醇等,购自Promega公司;过氧化物酶标记的二抗等为Sigma公司产品;所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成㊂1.3㊀病毒和细胞㊀采集山东省疑似猪瘟病料,包括淋巴结㊁肾脏㊁脾脏等,用GenBank公布的引物[6] HCV-1:5ᶄ-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3ᶄ;HCV-2:5ᶄ-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3ᶄ开展RT-PCR 检测㊂将检测为阳性的病料按照Liu,J.J的方法[12]接种PK-15细胞㊂
1.4㊀RT-PCR和E rns基因的克隆㊀取带毒细胞液200μL,参照TRLZol Reagent试剂说明书进行总RNA的提取,空气中自然干燥㊂用疫苗毒和灭菌水做阳性和阴性对照㊂
E rns基因的DNA合成参照TIANGEN的Quant One Step RT-PCR Kit说明书进行㊂E rns基因的特异性引物为E0-1:(5ᶄ-GAAAATATAACTCAATGGAAC-CTG-3ᶄ);E0-2:5ᶄ-ACAGTAAGGCGATAGGGC-3ᶄ㊂PCR反应体系为50μL,反应条件为10ˑRT-PCR Buffer(5μL),10mmol/L dNTP Mixture each(2μL), 5ˑRT-PCR enhancer(10μL),20U RNasin,2.25U Hotmaster Taq polymerase,Quant RTase for one step (0.5μL),primer E0-1(10μmol/L)(3μL),primer E0-2(10μmol/L)(3μL),RNA(template)(1μg), ddH2O(23.5μL)㊂一步法程序是:50ħ(30min), 94ħ(2min),94ħ(35cycles30s),线性化53ħ(30s),延伸65ħ(1min),最终延伸65ħ(10min)㊂用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物㊂
阳性PCR产物用TIANGEN公司的胶回收试剂盒回收并取4.0μL回收产物按TaKaRa公司
pMD18-T vector说明书克隆入T载体,经初步鉴定后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序㊂
1.5㊀序列与系统进化分析㊀分析测序结果,获得
E rns基因的全长cDNA序列,并对该序列进行生物信息学的分析,例如信号肽和糖基化位点预测㊂此外该序列经NCBI BLAST程序比对后,预测它的保守结构域,并寻找同源基因的存在㊂用DNASTAR软件包中的MegAlign程序分析36株参考毒株的蛋白质序列之间的相似性和趋异进化程度㊂序列比较的方法为CLUSTAL W方法㊂采用Mega3.1邻接法(Neighbor-joining Method)构建了系统进化树㊂利用TMHMM server v.2.0(Http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM-2.0/)软件分析其是否含有跨膜区㊂
1.6㊀pPIC9K-E rns基因重组质粒构建㊀设计合成重组质粒的特异性引物并扩增E rns基因,在5ᶄ端加EcoRⅠ位点,3ᶄ端加NotⅠ位点,引物序列如下:E0-3:5ᶄ-CGGAATTCGAAAATATAACTCAATG-GAACCTG-3ᶄ和E0-4:5ᶄ-ATTTGCGGCCGC ACAGTA-AGGCGATAGGGC-3ᶄ㊂将E rns基因及pPIC9K质粒载体均用EcoRⅠ酶和NotⅠ酶双切,琼脂糖电泳,回收酶切片段;将双酶切后的E rns基因片段及pPIC9K片段用T4DNA连接酶进行连接;连接产物转化感受态Top10(AMP+),用含AMP+的LB平板筛选阳性重组子,通过酶切PCR和测序等方法鉴定阳性克隆㊂
1.7㊀目的蛋白的诱导表达㊀将重组表达质粒pPIC9K-E rns和空质粒pPIC9K用SalⅠ酶切线性化,将其电转化到Pichi apastoris GS115酵母感受态中,取400μL铺于YPD平板上,28培养3d挑选生长良好的单菌落接种于2mL YPD培养过夜后,取新鲜的菌液3μL进行PCR鉴定,选特异性引物: AOX1:5ᶄ-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3ᶄ;AOX2: 5ᶄ-GCAA ATGGCATTCTGACATCC-3ᶄ,阳性菌落再利用G418对Mut型进行筛选㊂
选取PCR鉴定且经过筛选正确的重组菌接种至含10mL YPD培养基(1%酵母提取物㊁2%蛋白胨㊁2%葡萄糖)的试管中,30ħ,200r/min振荡培养过夜;次日以1%的比例(VʒV)接种至含100mL BMGY培养基(1.34%YNB㊁4ˑ10-7生物素㊁10%甘油㊁1%酵母提取物㊁2%蛋白胨㊁5%甘油)的500mL三角瓶中,30ħ,200r/min振荡培养约24h;离心并将菌体重悬于BMMY培养基(1.34%YNB4ˑ10-7生物素㊁
1%酵母提取物㊁2%蛋白胨㊁0.5%甲醇)中,28ħ,200r /min 振荡诱导表达4d,每隔24h 补加100%甲醇至终浓度为0.5%,按时间段取样进行分析㊂
将工程酵母菌在BMMY 培养基中诱导培养一定时间后,离心分别收集沉淀和上清,并将培养上清用硫酸铵沉淀法初步纯化,用2倍上样缓冲液与沉淀和纯化的上清蛋白等量混合进行SDS-PAGE 试验,以分析目的蛋白的表达㊂
1.8㊀蛋白印迹(Western-Blot)检测㊀将SDS-PAGE 的电泳产物转移至硝酸纤维素膜上,用5%脱脂乳封闭㊂用CSFV 阳性猪血清进行Western-Blot 检测㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀E rns 基因扩增产物的鉴定㊀我们从山东省猪瘟病毒株SDCQ 中得到了E rns 基因(序列号:
JQ911701),该cDNA 克隆全长为696bp (图1),编码一个232个氨基酸的蛋白质,其理论分子量为50kDa㊂其蛋白质具有RNA 酶的活性,包含一个RNase T2结构域
㊂
图1㊀E rns 基因的片段扩增
M:DL-2000Marker ;1:PCR 产物
2.2㊀序列与系统进化分析㊀经NCBI 里的BLAST 和SMART program (http://smart.embl-heidelberg.de /)分析发现,该cDNA 编码的蛋白质比较保守,有RNase T2保守结构域㊂TMHMM server v.2.0(Http://www.cbs.dtu.dk /services /TMHMM-2.0/)软件分析表明,E rns 不具有跨膜区㊂对SDCQ 株E rns 基因编码的蛋白与其他36株参考毒株的E rns 基因编码的蛋白进行系统进化分析发现:这些毒株分为两个基因群,4个亚群(图2),SDCQ 株属于Subgroup 1.1a,此亚群是有德国株Paderborn㊁3个台湾毒株和7个国内株组成的,同源性在93%~99%之间,由此可以推测该亚群病毒拥有共同的祖先;与Subgroup 1.1b 的同源性在91%~92%之间;而与Group2中参考
序列的同源性比较在84%~86%之间(见图2)㊂五个疫苗株:LPC /AHRI (Taiwan),HCLV (China),Riems (Holland),Chinese C strain 和Chinese vac-cine strain 聚集在一起,与Pan 等[5]之前研究得出的结论一致㊂值得注意的是,SDCQ 并没有与国内外经典的具有代表意义的毒株聚集在一起,由此可知,山东省内流行的CSFV 毒株与传统强毒株和疫苗用毒株在主要抗原编码基因上存在一定差异
㊂
图2㊀36株CSFV E rns 基因系统进化树
分析SDCQ 和其他19个参考毒株的氨基酸序列,E rns 具有两个保守区(CRs),分别位于aa 28~36和75~82区域(图3)㊂流行毒株与疫苗株在CR1区域存在差异,位于36位点的氨基酸E 被G 所取代㊂由此引出一个有趣的问题:此变化是否带来毒力的变化?序列中位于30位和79位的H(组氨酸)为RNase 催化活性关键氨基酸残基,此位点高度保守[6]㊂
2.3㊀pPIC9K /E rns 重组质粒与重组酵母菌的筛选㊀对重组质粒进行PCR 和双酶切鉴定㊂PCR 结果显示,有与目的基因相符的696bp 大小的条带;然后双酶切其质粒,电泳结果显示两条带,分别为9kp 左右和696bp(图4A),阳性质粒测序结果证明,E rns 基因
已正确插入pPIC9K 的多克隆位点上㊂
将电转化后的菌落作为模板,AOX1和AOX2为引物,进行PCR 检测,电泳结果显示1173bp 大
小的条带(图4B),与目的产物大小相符,阳性重组菌测序结果证明,pPIC9K /E rns 重组质粒正确整合入酵母菌中
㊂
图3㊀20株CSFV E rns
氨基酸序列分析
图4㊀重组质粒与重组菌的鉴定
A㊀1-3:PCR 鉴定重组阳性质粒;M:DL-2000Marker ;B㊀1-3:重组质粒酶切产物;M:DL-1kb Marker ;C㊀M:DL-2000Marker ;1,3:阳性重组菌;2:空质粒对照组
2.4㊀E rns 基因表达产物的SDS-PAGE 和Western Blot 分析㊀将筛选的转化子分别接种BMGY 和BMMY 培养基诱导表达后,将表达上清透析㊁浓缩后进行SDS-PA GE 结果显示,GS115/pPIC9K-E rns
转化子诱导产物在50kD 处出现与预计的以同源二聚体形式存在的E rns
大小相符的条带(图5A),与Western-Blot 结果显示一致(图5B),重组蛋白Erns
可
被CSFV 多抗血清识别,且显示两条杂交条带㊂这
一结果与van Gennip 等[7]研究结果相吻合
㊂
图5㊀表达产物SDS-PAGE 电泳及Western-Blot 分析
A㊀M:蛋白Marker ;1:带有pPIC9K 载体诱导的沉积物;2:有pPIC9K 载体诱导的上清;3:带有pPIC9K-E rns 重组质粒的酵母菌诱导的上清;4:GS115酵母菌诱导的上清;B㊀M:蛋白Marker ;1:带有pPIC9K 载体诱导的上清;2:带有pPIC9K -E rns 重组质粒的酵母菌诱导的上清
3㊀讨论
猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性接触传染性病毒病,对养猪业危害严重㊂猪瘟病毒是一种具有囊膜的单股正链RNA 病毒,属于黄病毒科瘟病毒属㊂其基因组包含一个大的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码一种由约3898个氨基酸残基组成的多聚体蛋白,该多聚体蛋白在病毒和细胞酶作用下加工成4种结构蛋白(C㊁E rns ㊁E1㊁E2)和8种非结构蛋白(N pro ㊁p7㊁NS2㊁NS3㊁NS4A㊁NS4B㊁NS5A 和NS5B)㊂
E rns 是猪瘟病毒所有蛋白中比较特殊的一种囊
膜糖蛋白,只存在于黄病毒科的瘟病毒属,是一种高度糖基化的蛋白㊂糖蛋白分子量约占E rns
总蛋白分子量的二分之一㊂在感染细胞中E rns 在内质网内
积累,并可存在于病毒粒子表面或被分泌到胞外㊂所以,E rns 蛋白很难在常用的细菌系统中获得有活性的蛋白㊂毕赤酵母(Picha pastoris)是一种甲醇营养型酵母,能够在以甲醇作为单一碳源的培养基上生
长,既具有原核生物易于培养㊁繁殖快㊁便于基因工程操作的特点,又具有真核生物的蛋白质加工㊁折叠㊁翻译后修饰的优点,同时其遗传比较稳定,能够密度发酵,蛋白的表达量高㊁且易于纯化,因此,毕赤酵母现已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型,是表达外源基因比较理想的宿主㊂本试验从山东省猪瘟病毒株SDCQ 中扩增到了
E rns 基因全长696bp,通过构建系统进化树发现SD-CQ 并没有与国内外经典的具有代表意义的毒株聚集在一起,由此可知,山东省内流行的CSFV 毒株与传统强毒株和疫苗用毒株在主要抗原编码基因上存在较大差异㊂序列分析发现,流行毒株与疫苗株在CR1区域存在差异,位于36位点的氨基酸E 被G 所取代,是否因此带来毒力的变化,还需进一步证实㊂通过构建pPIC9K-E rns 重组质粒,成功转化和筛选到一株多拷贝的工程酵母菌,通过甲醇诱导培养分泌表达了一定量的E rns 蛋白㊂West-ern-Blot 分析结果表明,表达的E rns 蛋白能识别天然猪瘟多克隆抗体,具有生物学活性,同时证实E rns 是以同源二聚体的形式存在㊂下一步试验将大量诱导E rns 蛋白,收集表达产物,经过纯化以期得到高产量蛋白,为基因工程疫苗和检测试验的研究奠定基础㊂参考文献:
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