PCR常见问题与对策分析

PCR常见问题与对策分析
【摘要】PCR（多聚酶链式反应.polymerase chain reaction）是从20世纪80年代发展的体外核算扩增技术。

PCR技术可以说是生物工程、生物医学领域的一项具有创时代意义的程碑，它具有简便、快速、重复性好、产率高、敏感、特也等诸多突出的优点，本文针对一些有关PCR技术中常见问题进行了分析。

【关键词】PCR技术；常见问题；问题分析
【中图分类号】Q503 【文献标识码】A 【文章编号】1005-0019（2014）03-0559-02
关于核算的研究已经有一百多年的历史了，20世纪60年代末开始，人们便致力于研究基因体外分的技术，在1985年Mullis等人发明了聚合酶链反应，其原理是在试管中给DNA的体外合成提供了适合复制的条件，与DNA的体内复制很相似。

但Mullis所使用的Klenow酶不耐高温，90摄氏度时会变性失活。

直到1988年，SaKi等人从嗜热杆菌中提取了一种耐高温的DNA聚合酶才得以解决这一问题。

在PCR 技术被人们广泛使用过程中，也出现了很多见或少见的问题，笔者对此类问题进行了总结及归纳，并给出了相应的对策。

1 片状带或涂抹带
在PCR扩增时偶尔会出现片状带、涂抹带或地毯样带等现象。

原因有可能是dNTP的浓度太高，，Mg2+的浓度太高，循环次数太多或者脱货温度太低等引起的；也可能是模板降解时，所使用的酶的质量太差或是酶的使用量过多所引起的。

出现此类问题时一般解决方法为：可以适当的降低dNTP 的浓度和Mg2+浓度、减少循环次数、升高退火温度、更换模板或增加模板量、减少酶使用量等。

2 扩增条带
PCR扩增的关键环节有很多，其中包括模板DNA的特性、酶的活性及质量、引物的特异性与质量、PCR扩增时的反应条件等，不出现条状带时应该对上述环节进行针对性分析。

（1）模板的来源不同，则在反应时所使用的量也会不同，模板的质和量不同，则反应效果有可能不同，如当真核基因组DNA作为模板时，所使用的模板量应该比原核的多。

模板的纯度也会对PCR扩增有一定的影响，如含有Taq或杂蛋白时会影响反应的效率。

（2）引物的质量、浓度、两条引物浓度是否相同是相影响PCR扩增时常见原因之一。

（3）由于Taq酶容易被污染或失活，也会影响反应PCR 的反应效果
（4）PCR产物的电泳检测时，最好为当日检测且一般不要超过48h，超过48h后会出现带形不规则，甚至消失等现象。

3 非特异性扩增带
PCR扩增后所出现的条带跟预计时的大小不同，或同时出现多个特异性扩增带或非特异性条带等，此类现象的发生可能以下几种可能。

第一种是引物与靶序列没有完全互补、或引物发生了聚合形成二聚体。

第二种是脱货温度过低、Mg2+的浓度过高或者是与PCR循环次数过多等因素有关。

第三种是酶量过多或酶的质量不合格。

对于此类现象的发生其对策主要包括重新设计引物，减少酶量或调换为零一种来源的酶、适当增加模板量，降低引物量，减少；循环次数，适当提高退火的温度或者可以采用二温度点法等。

4 假阳性
假阳性是指样品出现了目的DNA扩增条带的现象，其原因是存在扩增产物或模板的交叉污染，这种污染发生的原因有以下两种可能。

第一种是空气中的小片段核酸受到了污染，这些小片段比靶序列短，但是具有一定的同源性。

可互相进行拼接，与
引物进行互补后，可以扩增出PCR的产物，从而导致了假阳性的产生。

解决此类问题的对策是利用巢式PCR方法来消除或减轻。

第二种是大片段或整个基因组的交叉污染，导致了假阳性。

当出现这种假阳性时有以下几种解决方法：①为了防止目的DNA溅出离心管之外或吸入加样枪内，操作时应该尽量小心轻柔。

②将所有可以高压的器材或试剂进行高压消毒，所使用的进样枪头或离心管等均应一次性使用等。

③在必要时，加入标本之前，试剂和反应管等物品要进行紫外线照射，这样就可以破坏存在的核酸了。

5 母链结合
当PCR反应加热至90℃～95℃左右时，会使模板DNA 产生变形，解开时为单链。

当退火冷却至55℃～60℃左右时，因为引物分子量较小，运动速度较快，和母链碰撞的机会会很多，所以退火时引物优先会与母链互相结合。

引物如果太大，会导致退火时无法激发模板，即引物无法优先与模板链互相结合，而是与较多的互补模板链互相结合。

所以引物不能太大，一般不可以超过30个脱氧核苷酸的长度。

6 缓冲液
PCR缓冲液不仅对pH的变化有缓冲作用，而且有利于模板退火和引物的K离子，以及含有能够激活DNA聚合酶的Mg2+离子，还有DNA聚合酶的稳定剂等。

所以缓冲液中
通常会含有MgCl2、Tris?HCl（pH =8.4，室温）、KCl、明胶等。

Mg2+离子对Taq酶的活性以及专一性都具有一定的影响，Mg2+离子浓度过高时，Taq酶专一性降低而活性会加强，所以当Mg2+离子的浓度过高，会导致非特异性扩增产物积累，而当Mg2+离子的浓度过低，会导至扩增量降低。

MgCl2最佳浓度一般为1.5mmol/mL左右。

7 原料以及反应体系
加入PCR反应体系中的dNTP（是四种脱氧核苷磷酸的统称），即：dCTP、dTTP、dGTP、Datp，它们分别由，四种普通的脱氧核苷酸在消耗ATP的基础之上活化而形成的。

例如：ATP+dNDP→ADP+dNTP。

由此可见dNTP是消耗了ATP 活化的脱氧核苷酸，已经具备了反应时所需要的所有能量，所以PCR反应体系不需要再添加ATP了。

8 结语
近几年来，众多学者对PCR技术进行了研究与改进，经过他们不断的探索与创新，PCR技术有了进一步的发展与完善，并且已经派生出反转录PCR、原位PCR、荧光PCR、单细胞PCR等各式各样的新型的PCR技术，并且这些PCR技术进行相互融合，继而为分子生物学领域的研究的深入开展提供了高质量的技术方面的保障，为公共卫生事业提供了快捷、方便、灵敏的检测手段，为生命科学的研究及发展打开了一扇扇崭新的大门。

参考文献
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