10质粒提取生物化学与分子生物学实验

1:10000添加荧光染料
四、操作步骤
6、琼脂糖凝胶电泳 （2）上样、电泳和观察
10 μl 质粒溶液与 1.5 μl上样缓冲液混匀
上样完成后 电压100 V 电泳
将凝 胶放 置于 电泳 槽中
溴酚蓝距凝胶边缘2cm停止电泳，于254nm紫外光观察
注意事项
1、转化操作过程中，感受态细胞需要在冰上融化，加入质粒后轻 轻混匀；
目录
01 实验原理
03 实验步骤
02 所用试剂和器材 04 注意事项
一、实验原理
质粒简介： ➢闭合双链DNA； ➢存在于细菌的细胞质中、独立于 染色体之外可主复制的遗传成份。
一、实验原理
质粒对细菌具有重要意义
一、实验原理
碱裂解法小提质粒简介
➢ 菌体在NaOH和SDS溶液中裂解， 蛋白质与DNA发生变性；
➢ 加入中和液后，质粒DNA分子能够 迅速复性，且呈溶解状态，离心后 位于上清液中；蛋白质与染色体 DNA不复性而呈絮状，离心后沉淀；
➢ 将质粒纯化。
一、实验原理
质粒的检测方法： 琼脂糖凝胶电泳简介
琼脂糖凝胶--均匀介质，胶的浓度不 同导致其孔径不同，达到不同的分 离效果；
DNA--带负电，电泳的快慢与分子 大小和形状有关；
取10µL质粒加入到 100µL感受态菌体中，
冰浴30min
42℃，90 S
冰浴，2.5 min
加800 µL LB培养基
37℃恒温培养
涂布
6000 rpm X5 min 摇床，50 min
四、操作步骤
2、挑菌
挑取单菌落放到含相应 抗生素的LB培养基中
37℃剧烈振摇培养12小时左右
四、操作步骤
3 、细菌的收集
Marker---DNA分子大小的标尺； 上样缓冲液---沉降DNA、指示作用。
二 、仪器设备及耗材 空气震荡摇床，离心机，微量移液器，枪头， EP管，涡旋混匀器，水浴锅。
三 、试剂
试剂I，试剂II，试剂III ，无水乙醇，70%乙 醇，TE溶液 ，菌液 , RNase，乙酸钠。
四、操作步骤
1 、细菌转化
1.2 mL菌液于 1.5 mL EP管中
10000 rpm离心30 s
弃去上清液，使细菌 沉淀尽可能干燥
四、操作步骤
4、细菌的裂解
100 µL溶液Ⅰ 重悬细菌
200 µL溶液Ⅱ 颠倒混匀
150 µL溶液Ⅲ 混匀后静置3min
10000 rpm 离心5min
四、操作步骤
5、质粒DNA的回收
转移上清液到新 的EP管中，加2倍 体积无水乙醇， 1/10体积乙酸钠
10000rpm离心5min 1mL 70％乙醇
37℃水浴5 min 贮存于-20℃
50 µL TE 1 µL RNase
弃去乙醇 晾干5~15min
10000rpm 离心2min
四、操作步骤
6、琼脂糖凝胶电泳 （1）制备凝胶
准备好模具0.4 Fra bibliotek琼脂糖 50 ml TAE
微波炉内溶解
倒入模具，等待凝固
2、提质粒加入溶液II和溶液III时，需要轻轻颠倒混匀，不要剧烈 震荡；
3、制备琼脂糖凝胶过程中，摇晃不要太剧烈；加入染料时温度不 能太高；倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀；速度也不 可太快，否则容易出现气泡。