基因工程菌质粒的稳定性

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(附具体方法)基因工程菌质粒(遗传)稳定性--原创

质粒遗传稳定性目前没有明确的规定，但一般用斜面传代法，一定数量点接抗性和非抗性板，生长计数（主要证明分裂稳定性）；更严谨时，可进一步双酶切、测序等验证（证明结构稳定性--国家药品监督管理局的新生物制品审批）。

工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌都是经过10代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。

菌体不稳定造可能成的损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在2-3代菌就没有产量或者产量低的菌株。

一般来说，一代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步做种子罐，最后才能用于生产。

如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。

质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选，实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免，做好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免了一代菌用完之后就没有更好的使用。

使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使用合适的宿主，还是很容易得到没有突变的质粒的，后续连续传代培养也可以得到比较稳定的质粒的。

质粒不稳定是重组基因工程菌培养过程中的常见问题，也是影响外源基因高效表达的限制因素之一[77~78]。

Koch[79]最早对外源基因引入宿主而对细胞产生的代谢负荷进行考察，研究表明质粒的大小、拷贝数，质粒的维持，抗性基因的表达，培养环境的变化，都会对宿主细胞产生代谢负荷，当供氧不足或营养物质受限制时，代谢负荷对细胞生长的影响会更加明显。

基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式: 一种是重组DNA 质粒的丢失, 称为脱落性不稳定; 另一种是质粒中的基因结构发生突变, 称为结构性不稳定。

基因工程菌培养及其不稳定性

5. 搅拌器转速和通气应适当
6. 空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料
7. 培养液要经化学处理或热处理后才可排放
8. 发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。
9. 轴封可采用磁力搅拌或双端面密封
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中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并
可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密
度菌体。
膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成
循环流速，开始透析的时间、透析培养的持续时间段都对产物的产率
有影响。
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一、基因工程菌的培养方式
5. 固定化培养
基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
提高发酵罐的供氧能力。
有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因
而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从
而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的
方法都可提高质粒的稳定性。
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提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
pH pH 影响重组菌的稳定性。
5. 控制培养条件
限制性基质
一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。
限制性基质的种类对重组菌有不同的影响
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提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
溶解氧
在基因重组菌的高密度培养时，为了ห้องสมุดไป่ตู้持所需的溶氧水平，除

(完整版)生物技术制药习题答案(夏焕章版)

第一章绪论填空题1. 生物技术制药的特征高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。

2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是治疗药物、预防药物、诊断药物。

3.现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；二是基因药物；三是来自动物植物和微生物的天然生物药物；四是合成与部分合成的生物药物；4.生物技术的发展按其技术特征来看，可分为三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。

5.生物技术所含的主要技术范畴有基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程；选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D 基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D 7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。

2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。

3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。

简答题1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。

基因工程菌的发酵控制

基因工程菌的发酵控制近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。

从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。

1 、营养源浓度的控制由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。

为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。

但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。

此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。

常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。

使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。

2 、质粒的不稳定性及其控制在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。

带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。

此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。

由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。

质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。

前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。

为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。

基因工程菌的培养

基因工程菌的培养
发酵过程：两种菌的混合物的发酵过程
一．工程菌大规模培养的两个关键
1.工程菌的稳定性
不稳定的原因：质粒的不稳定：质粒的丢失
重组质粒发生DNA片段脱落
表达产物的不稳定
工程菌不稳定的因素：培养基的组成（合成培养基有利于宿主细胞的生长，不利
于外源基因的表达）
培养温度（低温有利于重组质粒的稳定遗传）
菌体的比生长速率
控制基因的过量表达
二、溶氧量
溶氧量过低时，说明葡萄糖过量，此时应降低流加速率；当溶氧量过高时，说明葡萄糖即将耗尽，此时应加大流加速率。

当甲醇流速过快时，溶氧量上升：当甲醇流加速率过慢时，溶氧量降低。

三、毕赤酵母
为甲醇利用型酵母，能以甲醇为唯一碳源和能源生长。

甲醇利用途径的第一个酶为醇氧化酶。

生长在限量甲醇中的细胞能诱导出大量该酶，而生长在甘油、葡萄糖或乙醇中的细胞却不能产生该酶。

因此利用醇氧化酶基因作为启动子来构建表达系统而高效表达外源蛋白。

四、重组毕赤酵母具体方法（三段法）
第一阶段：在甘油或葡萄糖为碳源的合成培养基中进行工程菌的分批培养，以累积菌体细胞。

第二阶段：在限制生长速率下流加甘油或葡萄糖的流加补料培养，以进一步提高菌体量。

第三阶段：即诱导阶段，开始较低速度流加甲醇，以诱导外源蛋白的表达。

（要控制甲醇的流加量，浓度高于5g/L时，将会严重抑制细胞的生长。

基因工程菌的稳定性

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发酵罐的组成有：
发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统。
对发酵罐要求：提供菌体生长最适生长条件，培养过程不得污染，保证纯菌培养，培养及消毒过程不得游离异物，不能干扰细菌代谢活动等。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
⒋ 溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。
发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下降，发酵后期下降幅度更大。
外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。
第五节基因工程菌的稳定性
基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为：分裂不稳定结构不稳定
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变

重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究

重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究摘要基因工程菌中质粒稳定性对于基因工程菌的发酵有着重要影响，但基因工程菌在传代中经常出现质粒不稳定遗传的现象。

本试验通过在工程菌的培养过程中添加抗生素这一选择压力和诱导表达目的蛋白的方式来提高基因工程菌的稳定性，并通过双酶切电泳分析及高效率的诱导表达外源蛋白来进行检测，得出工程菌在LB（-）和LB（+）平板上都能生长且形态相似；电泳图平行、酶切片段的位置大致一致；诱导表达的外源基因的质粒稳定。

提高质粒稳定性有利于外源蛋白表达，以满足大规模生产发酵。

关键词：基因工程菌；质粒；稳定性-I-Study on the stability of plasmid of recombinanthuman IL-2 E.coli bacteriaAbstractEscherichia coli. plasmid stability for the genetic engineering of bacteria fermentation has important implications genetically engineered bacteria in the mid-recurring genetic instability of the plasmid. This experiment in engineering from the training course to add the option of antibiotic pressure and protein expression induced by way of reference high genetically engineered bacteria stability and digested by electrophoresis and high efficiency induced expression of foreign proteins to detect, the virus can grow in the panel of LB(-) and LB(+), and the morphology is similar; The electrophoregram is parallel, and the position of the fragment is consistenct roughly; Inducible expression of foreign genes is stabile. We improve the stabilization of the foreign gene in order to meet the large-scale fermentation.Key words: Genetic engineering ; plasmid ; stability-II-目录摘要 (I)ABSTRACT ............................................................................................................................... I I 前言. (1)1 材料与方法 (3)1.1试验材料 (3)1.1.1 菌种质粒 (3)1.1.2 培养基 (3)1.1.3 常用药品 (3)1.1.4试验仪器 (3)1.2试验方法 (3)1.2.1 基因工程菌的转化 (3)1.2.2 制平板 (3)1.2.3 连续传代 (3)1.2.4 鉴定 (4)2 结果与分析 (6)2.1不同代菌的传代结果 (6)2.2上述不同代质粒的电泳图 (8)2.3不同代质粒的酶切图 (9)2.4诱导表达不同代的基因工程菌的外源基因蛋白电泳图 (10)3 讨论 (11)3.1分析本试验所出现的问题 (11)3.2质粒稳定性影响的若干因素 (12)3.2.1 含调控型启动子的基因工程菌稳定性控制 (12)3.2.2 选择性培养基提高质粒稳定性 (12)3.2.3 培养操作方式对工程菌稳定性的影响 (12)3.2.4 培养条件对工程菌稳定性的影响 (12)4 结论 (14)参考文献 (15)致谢 (17)-III-前言随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展，运用重组表达技术来生产预防和治疗疾病的制品已成为近几年研究的热点。

生物技术制药试题及重点(最新整理)

第一章绪论填空题1. 生物技术制药的特征高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。

2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是治疗药物、预防药物、诊断药物。

5.生物技术所含的主要技术范畴有基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程；选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。

2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。

3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。

基因工程菌的不稳定性

的综合调节措施
• 工程菌的培养一般分为2个阶段：（1）第一阶段----先使菌体生长至一定密度。（2）第二阶段----开始诱导外源基因的表达。
• 由于第一阶段外源基因没有表达，减少了丢失质粒的细菌的产生概率，也就增加了
工程菌的稳定性。
• 因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养基环境中是不能正常生长的。
（2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数B；
（3）计算出B/A的比值。该比值能够反映出质粒的稳定性。
• 因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养基环境中是不能正常生长的。
பைடு நூலகம்
二、提高质粒稳定性的方法
1、分阶段培养法 2、在培养基中加入抗生素，形成选择性压力 3、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧
• 含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，对质粒的稳定性不利。
质粒稳定性的分析方法
（1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基上，培养 10-12小时，统计所长出的菌落数A；
• 所以可以通过加入抗生素来抑制质粒丢失的细菌的生长。
• 通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施
• 通过以下方法可以提高质粒的稳定性。
（1）间歇送氧（2）改变稀释速率
基因工程菌的不稳定性
一、质粒不稳定产生的原因分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。(常见) 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变

关于基因工程菌的稳定性

关于基因工程菌的稳定性摘要：研究了定态与周期操作对基因工程酒精酵母质粒稳定性的影响,周期操作有利于提高底物的利用率并增强质粒的稳定性；发现了固定化重组菌高稳定性的原因，另外还讨论了诸多培养条件对基因工程菌稳定性的影响。

关键字：固定化；基因工程菌；质粒；稳定性；基因工程基因工程菌就是将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌成为基因工程菌。

基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。

质粒不稳定可分为：分裂不稳定和结构不稳定。

分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。

结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

1 常见分裂不稳定的两个因素：1.1 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；1.2 这两种菌比数率差异的大小。

2 提高质粒稳定性的方法2.1 选择合适的宿主菌；2.2 选择合适的载体，适当增加质粒拷贝数；2.3 加入选择性压力；2.4 采用两阶段培养法；先使菌体生长至一定密度，再诱导外源基因的表达。

由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。

在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。

调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。

有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。

通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。

2.5 控制工程菌的培养条件；2.6 采用固定化培养基因工程技术是生物技术的核心和关键,已成功地表达了一系列与人类健康有关的重要多肽物质以及使多种氨基酸和抗生素增产,对人类社会生活产生了深远的影响。

基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式:一种是重组ＤＮＡ质粒的丢失,称为脱落性不稳定;另一种是质粒中的基因结构发生突变,称为结构性不稳定。

这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。

工程菌

• 原因：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体
质粒结构的不稳定
定义：指外源基因从质粒上丢失或者碱基重排、缺失而导致的工程菌性能的改变原因：由转位作用和重组作用所引起的质粒DNΑ的重排与缺失。
1. 质粒不稳定产生的原因
• 质粒的不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。
⒋ 溶解氧
• 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。 • 当溶解氧强度大时生长速率较高，染色体复制增加， • 若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率 • 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。 • 温和的搅拌速率适于保存质粒的稳定性。在搅拌罐发酵时，质粒拷贝数通常比摇瓶培养低
⒉接种量
• 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。
• 接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。
⒊ 温度
• 有的质粒属温度敏感型质粒，如农杆菌质粒，当农杆菌培养温度超过30℃，即引起质粒丢失；Kwang H.Son等也发现培养温度处于30℃～44℃时，巨大芽孢杆菌PCK108质粒结构基本稳定，而且其目的产物——纤维素酶产量比 30℃时显著提高，但30℃时质粒稳定性较强。
• 由于第一阶段外源基因未表达从而减少了重组菌与质粒丢失菌的比生长速率的差别，增加了质粒的稳定性。 • 连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌体的稳定性，在第二级进行表达。
发酵工艺条件的优化
对发酵影响较大的几个因素有： ⒈培养基的影响 ⒉接种量的影响 ⒊温度的影响 ⒋溶解氧的影响 5.pH的影响
Shine-Dalgarno（SD） sequence