微生物--土壤放线菌的分离与鉴定

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土壤放线菌分离实验

培养基高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20．00g、NaCl 0．50 g、KNO3 1．00 g、K2HPO4·3H2O 0．50 g、MgSO4·7H2O 0．50 g、FeSO4·7H2O 0．01g、琼脂粉18．00g，加去离子水定容至1 000 mL，调至pH 7．0，121 ℃高压灭菌20 min.

土壤取样方法：在水稻根部周围，先去除表面2厘米的土后，采用5点取样法取土，混匀。

稀释涂布分离法：取新鲜的土壤5g，与45ml的无菌水混合，摇床要20min，把摇好的10^-1的液体静置待颗粒沉淀后，取1ml加入到有9ml无菌水的试管中，混匀，就到10^-2的稀释液，再从10^-2的稀释液中吸取1ml加入到9ml无菌水的试管中，混匀，就到10^-3的稀释液，类推就可以得到10^-4、10^-5的稀释液。

把灭过菌的100ml的高氏Ⅰ号培养基带温度到60-70左右时加入过0.45um滤膜的0.05g/ml的高锰酸钾溶液100ul、0.1g的氯霉素、0.2ml的庆大霉素，摇匀，倒平板。用10^-3、10^-4、10^-5三个浓度涂平板。

放线菌发酵：用不加琼脂高氏Ⅰ号培养基接入菌株，在28 ℃、280r/min 摇床培养7d。过滤，取滤液。滤液保存在4℃。

莴苣生测：菌液过0.45um的滤膜5ml，加入到有5棵冒芽的莴苣的组培瓶中（每个重复3次）。

稗草生测：与莴苣生测雷同。

放线菌的分离与筛选方法

放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。

1.拮抗放线菌的筛选方法：

1.1平板划线法：

待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。选择抑制活性强的复筛。

1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法

将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。

1.3纸片法或生长速率法：

主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测

发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有

无抑菌圈或抑菌圈的大小。

2.放线菌分离与筛选.

2.1培养基；

2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）

放线菌的分离与筛选方法

1.拮抗放线菌的筛选方法：

1.1平板划线法：

1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法

1.3纸片法或生长速率法：

主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测

发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有

无抑菌圈或抑菌圈的大小。

2.放线菌分离与筛选.

2.1培养基；

2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）

实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集

1 目的

1.1 了解微生物分离和纯化的原理

1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法

2 原理

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。 3 材料

3.1 培养基

淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。3.2 仪器或其它用具

取样铲、塑料袋、记号笔、

1．布点：按照土壤类型和作物种植品种分布，按土壤肥力高、中、低分别采样。一般150-300亩（不同地区可根据情况确定）采取一个耕层混合样，采样点以锯齿型或蛇型分布，要做到尽量均匀和随机。应用土壤底图确定采样地块和采样点，并在图上标出，确定调查采样路线和方案。

2．采样部位和深度：用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样0.5-1kg，在采样过程中，采取的混合样一般都大于该重量，所以要去掉部分样品，将所有采样点的样品摊在塑料布上，除去动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品整碎，混匀，摊成园形，中间划十字分成四份，然后对角线去掉两份，若样品还多，将样品再混合均匀，再反复进行四分法，直至样品最终重量要求0.5-1公斤（试验用的样品2公斤）为止。如下示意图。一用取土器或锄头直接挖入耕层取样。每个点切取的土块宽度、厚度应

实验二-----土壤中放线菌的分离

实验讲义5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法

取土样时最好选取如花坛等地方的土样，去掉表层5～10cm的土壤后取样.

放入100ml三角瓶中,加入30ml水，常压加热至水沸腾后维持20min，取出，置28-37摄氏度培养24—48h，液面则产生黄白色皮膜。

用接种环取皮膜适量于无菌水中分散，稀释涂布于蔗糖豆芽汁琼脂平皿，置28—37摄氏度培养24-48h，挑取典型菌落。

实验6土壤中放线菌的分离（实训）

实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法.

2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术.

实验材料：

药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂。

其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。

实验原理：

高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基.这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4•3H2O 、MgSO4•7H2O作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素,提供铁离子等组成。

放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理(120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌.再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。

土壤中放线菌的分离

分离土壤中的放线菌的步骤如下：

1. 准备培养基：选择适合放线菌生长的培养基，常用的包括土壤提取物富集培养基、葡萄糖琼脂糖培养基、镜菌素琼脂糖培养基等。

2. 取样：在选择好的采样地点，使用消毒的工具（如消毒棉签或无菌铲子）采集土壤样品。注意避免土壤样品的污染。

3. 预处理：将采集到的土壤样品放入无菌研钵中，加入合适的无菌生理盐水或者缓冲液，悬浮土壤样品，使放线菌被更好地释放出来。可以对土壤样品进行稀释处理，以降低微生物密度。

4. 稀释平板法：将预处理好的土壤样品用无菌移液管分别

在培养基平板上均匀涂布。然后放入恒温培养箱进行培养。孵育时间一般为3-4周。在培养箱内，放线菌会产生菌落

形成。

5. 单菌分离：在培养箱内观察到单个的放线菌菌落后，使

用消毒的工具将其分离到新的培养基上，形成纯种菌落。

这一步可以采用传统的传代分离法或微量分离法。

6. 纯种菌株保存：将得到的纯种菌株存储在适当的冻存管中，通过冻存进行长期保存。

需要注意的是，在进行上述步骤时，需要严格遵守无菌操

作的原则，避免样品或培养基的污染，以保证得到纯种的

放线菌菌株。

土壤中放线菌的分离和纯化实验

一、实验目的

1、制作MS培养基的方法，掌握母液的保存方法。

2、掌握培养基的灭菌方法。

掌握外植体的消毒和超净工作台的使用。

4、掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程；

5、掌握高氏一号培养基的配制方法；

6、复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方学会使用高压蒸汽灭菌锅。

7、培养微生物实验的设计思路和动手能力。

二、实验材料

高压蒸汽锅、培养瓶、石斛的愈伤组织、超净工作台，酒精灯、酒精棉球、镊子、电子天平、称量纸、烧杯、量筒、

显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、分析天平；接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀

三、实验原理

植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）

或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。

四、实验步骤

1、配制MS培养基8L，称取马铃薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、琼脂80g、配制

母液。2、配制培养液时应注意：

①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；为防止母液被微生物污染，有机母液放在冰箱里4℃保存；

②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；

放线菌实验报告

一、引言

放线菌是一类广泛存在于土壤和水体中的微生物，其具有重要的生物学意义和

应用价值。本次实验旨在通过对放线菌的培养、鉴定和抗菌活性测试，了解放

线菌的特性和应用前景。

二、材料与方法

1. 放线菌培养基的制备：将葡萄糖、酵母粉、肉膏粉、胰蛋白胨等按一定比例

溶解于蒸馏水中，加热煮沸，倒入培养瓶中，待冷却后加入抗生素。

2. 放线菌的采集：在适宜的环境中采集土壤或水样，并将样品分装于离心管中。

3. 放线菌的分离：取适量样品并加入适量的生理盐水，摇匀后进行稀释，取适

量稀释液分别均匀涂布于放线菌培养基上。

4. 放线菌的纯化：从培养基上挑选出单菌落，进行连续传代，直至获得纯种放

线菌。

5. 放线菌的鉴定：通过形态特征、生理生化特性和分子生物学方法对放线菌进

行鉴定。

6. 抗菌活性测试：采用平板扩散法或孔隙扩散法，将放线菌菌液或提取物涂布

于琼脂平板上，观察抑菌圈的形成情况。

三、结果与分析

经过培养和分离，我们成功获得了多个放线菌菌株。在鉴定过程中，我们观察

到这些放线菌菌株形态各异，有的呈现棕黄色，有的呈现淡黄色，有的呈现灰

白色。此外，通过生理生化特性的检测，我们发现这些放线菌菌株对某些碳源

和氮源具有不同的利用能力。进一步的分子生物学分析结果显示，这些放线菌菌株属于不同的物种。

在抗菌活性测试中，我们选取了几个放线菌菌株进行了评估。结果显示，这些放线菌菌株对多种细菌具有一定的抑制作用。其中，某一放线菌菌株对金黄色葡萄球菌表现出了较强的抗菌活性，形成了较大的抑菌圈。这表明该放线菌菌株可能具有潜在的抗生素生产能力。

放线菌的分离

实验五：土壤中放线菌的分离

实验学时：5学时

实验类型：验证性实验、综合性实验

实验要求：必修

一、实验目的

从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。

二、实验内容

筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。土壤中放线菌最丰富，品种齐全。通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。

对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。

土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。

注：从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。

实验二土壤中微生物的分离纯化及观察

实验器材菌种土壤样品分离纯化后得到的放线菌和霉菌细黄链霉菌曲霉青霉根霉毛霉培养基高氏号琼脂培养基察氏琼脂培养基溶液或试剂01美蓝染色液乳酸石碳酸棉蓝染色液仪器或其他用具显微镜盖玻片载玻片接种环平皿解剖针倒平板取孢子划线接种无菌操作将灭菌的盖玻片以大约45扦在接种线上28倒臵培养35d培养后的盖玻片直接镜检或用01美蓝对盖玻片染色后观察观察基内菌丝气生菌丝孢子丝的卷曲状况以及分生孢子的形状并绘图说明
实验结果
➢ 你所观察到的细菌是否都有鞭毛？是否都能运动？绘图表示有鞭毛细菌的形态特征。
思考题
➢ 用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌是否具有鞭毛，要注意哪些环节？
七、酵母菌的形态观察及大小、数量测定
目的要求 ➢ 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式； ➢ 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法； ➢ 学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法； ➢ 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
涂片固定脱色
番红复染2-3min 干燥后油镜观察
孔雀绿初染番红复染
芽孢染色
实验结果
➢ 绘图说明你所观察到的芽孢杆菌的形态特征（注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形状特征）。Βιβλιοθήκη Baidu
思考题
➢ 说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？
➢ 用Schaeffer-Fulton氏染色法加热染色时，若因一时疏忽玻片上的染液被烘干，此时能否立即补加染液？为什么？

土壤中放线菌的分离 (2)

土壤中放线菌的分离

简介

放线菌（Actinomycetes）是一类广泛存在于地球各种土壤中的微生物，具有丰富的生物活性代谢产物和生物学功能。分离土壤中的放线菌对于获得新的生物活性物质和解析放线菌菌株有着重要意义。本文将介绍土壤中放线菌的分离方法及过程，并提供一些实践经验。

分离方法

样品收集

选择合适的样品收集地点至关重要。一般情况下，草地、

农田、果园等土壤中含有较丰富的放线菌资源。在进行样品收集前，应先清理收集工具和容器，并使用无菌绳固定收集区域，避免外界杂质污染。

样品处理

1.从采集的土壤中取得样品，并将其放入无菌锥形瓶

中。

2.将样品添加至无菌水中，形成土壤悬浮液。可以通

过搅拌或振荡等方式充分悬浮土壤颗粒。

3.通过离心的方法，去除悬浮液中的大颗粒和杂质。

分离培养基的制备

分离出放线菌的选择培养基非常重要，一般常用的培养基有：

•考马斯琼脂培养基（Koj A）

•聚芽孢杆菌琼脂培养基（SGA）

•苯丁三唑糖脂琼脂培养基（BIS）

其中，考马斯琼脂培养基是最为常用的一种，可以选择性地培养出放线菌。

分离操作

1.在无菌条件下，将处理好的土壤悬浮液均匀涂布于

分离培养基上。

2.用一次性平皿、玻璃块或玻璃棍等工具均匀划开土

壤悬浮液，以增加放线菌的分离点。

3.培养皿密封后，放入恒温培养箱进行培养，通常在

28-30℃下培养7-10天。

鉴定和筛选

在培养箱中培养的结果显示出放线菌的单独菌落后，可以进行以下鉴定和筛选步骤：

1.观察和记录菌落形态特征，包括颜色、形状、质地

等。

2.进行显微镜下的形态观察，例如菌丝形态、芽孢形

实验四、土壤中放线菌的分离

一、实验目的

1、从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。

2、了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。

二、实验内容

土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。

三、实验原理、方法和手段

【全面版】实验八土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化PPT文档

三、实验材料
1、菌源：自备。 1、在你所制备的培养基的平板上长出的菌落分别属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。
1、熟悉从自然界中分离微生物的原理；微生物四大类菌的分离和培养
2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号培养基， 3、为什么要把培养皿倒置培养？
2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 3、为什么要把培养皿倒置培养？
方法。
二、实验原理Βιβλιοθήκη Baidu
微生物四大类菌的分离和培养
3、为什么要把培养皿倒置培养？ 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？微生物四大类菌的分离和培养 4、其它物品无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒、称量纸、药勺、橡皮头、10％酚溶液。 2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号培养基，马丁氏培养基，豆芽汁葡萄糖培养基 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 3、为什么要把培养皿倒置培养？ 1、在你所制备的培养基的平板上长出的菌落分别属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理； 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理；微生物四大类菌的分离和培养 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理； 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？娘钝漆疃坡践涛透菸侣匙育祧髌刀昶濞浆昧沌掼拾葩涑协憬耙侍辐虚枪讣悬维告军涉镛操崮内颁柢簦萼乎靓屮痔赘诺歇晷郏痒訇呔漳喔俏顼闼铒猷聋肯跹缮劈存斫猥览倘阪降吞谄侵话砌撮陡翘缨孪鬟蝣酵母菌及霉菌的分离与纯化娘钝漆疃坡践涛透菸侣匙育祧髌刀昶濞浆昧沌掼拾葩涑协憬耙侍辐虚枪讣悬维告军涉镛操崮内颁柢簦萼乎靓屮痔赘诺歇晷郏痒訇呔漳喔俏顼闼铒猷聋肯跹缮劈存斫猥览倘阪降吞谄侵话砌撮陡翘缨孪鬟蝣 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 2、掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的分离纯化方法。

土壤中微生物的分离与鉴定实验报告

Sdu微生物大实验

土壤微生物的分离纯化与鉴定

【实验目的】

1、从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；

2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方

法和无菌操作技术。

3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。

4、掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。

【实验原理】

1、微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称

为微生物的分离与纯化。此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。 b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。

2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段

分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。

放线菌的分离与鉴定

一﹑实验目的：通过对放线菌生理生化特点的研究，1学会从土壤中观察到放线菌菌落形态。2学会从土壤中分离出放线菌。

二﹑实验原理：放线菌在自然界中分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤空气和水中。放线菌具有分支状菌丝，革兰染色为阳性。放线菌的孢子也具有不同的形状，有球形、椭球形、杆状、柱状。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，可以用合成培养基培养，放线菌常用稀释平板法分离。通过稀释平板法和涂布法，可以使放线菌在固体培养基上形成单独的菌落，挑取后在镜检能到纯菌株。

三﹑药品和材料：土样，革兰氏染液，高氏一号合成培养基

四﹑实验方案：

1培养基的配置（就是配置高氏一号合成培养基）

(高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基，是采用化学成分完全了解的纯试剂配制成的培养基。高氏培养基加入酚可抑制细菌与霉菌而不抑制放线菌)

2土壤中放线菌的分离

（1）待测样液的制备：取5只干燥无菌试管，编号，分装，在无菌纸上称取样品5 g土样，放入有无菌水的三角瓶中，振荡，用吸管吸取0. 5ml 注入4. 5ml 无菌水的试管，混匀，作为10-1稀释液，类推依次制成10-2、10-3、10-4、10-5几种稀释度的土壤溶液。(如果稀释度不够，放线菌抑制了或者菌落太小，而其他细菌的菌落又太多，不容易找到) (2）稀释平板法与涂布法相结合分离土壤中放线菌：取2支1ml移液管分别从10-4、10-5菌悬液中吸1ml菌悬液，放入编号为10-4、10-5的培养皿内。将高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，混合均匀等到凝固。从稀释度为10-2、10-3、10-4、10-5，的菌悬液中分别吸取0. 1ml 涂布在高氏一号平板培养基上，每个稀释度涂三个平板。（3）划线：挑选出不同的单菌落，并在平板上进行三次划线。（4）培养：将平板放在28℃培养箱中培养7天。（5）

放线菌的分离和鉴定

实验器材：

1.土壤材料 5 ---10cm 处土壤，放于采集袋中带回实验室。

2.培养基

淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基( w /v)）

可溶性淀粉2%，KNO3 0. 1%，NaCL 0. 05%，K2HP04 0. 05%，MgSO4 0. 05%，FeSO4 0. 001%，琼脂2% 3.溶液和试剂

（1) 20% 甘油( 2) 0. 1%美蓝 A 液: 美蓝0. 3g ，95% 乙醇300ml;B 液: 0. 01% KOH 100ml 混合A 和B 液即成

革兰氏染液3( 1) 结晶紫染色液: 甲液结晶紫2g，95% 乙醇20ml;乙液草酸铵0. 8g，蒸馏水80ml。甲乙液先分别溶解，然后混合在一起，过滤除去残渣后装入滴瓶中备用。

( 2) 碘液: 碘1g，碘化钾2 个，蒸馏水100ml 先取少量蒸馏水加入碘和碘化钾，使碘完全溶解后再加入全部蒸馏水，分装于滴瓶中备用。

( 3) 复红酒精溶液: 碱性复红0. 4g，95%乙醇100ml，溶解装入滴瓶备用。

4.仪器和其他用品

无菌纸、带玻璃珠的三角烧瓶、1ml无菌吸管、无菌试管、无菌培养皿

一.目的要求：

1. 掌握倒平板的方法和常用分离纯化微生物的基本操作。

2. 初步观察土壤中放线菌菌落形态。

3. 初步了解掌握微生物分类的基本方法。

二.实验原理：

放线菌在自然界中主要生存于陆地和淡水中，土壤为这类微生物的主要习居场所，无论在种类和数量上都比其他地方繁多。在中性或偏碱性的土壤和有机质等丰富的土壤中较多。放线菌以孢子和菌丝片段的形式存在于土壤，每克土壤内含有数万、数十万的孢子。