05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电

合集下载

质粒DNA的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳

片段 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10a 10b
碱基对 10,002
8,001 6,001 5,001 4,001 3,001 2,000 1,500 1,000
517 500
质量 42 ng 42 ng 50 ng 42 ng 33 ng 125 ng 48 ng 36 ng 42 ng 42 ng* 42 ng*
1 kb DNA ladder（共10条带）: 在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入6l 的 1 kb DNA ladder（50ng/l ）。
5）电泳（带上手套操作）
• 加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；
• 建议在80～100V的电压下电泳；
• 当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳；
1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型 3) 核酸限制性内切酶的基本特性 4) 同裂酶和同尾酶 5) 核酸限制性内切酶的命名法 6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
1) 寄主控制的限制与修饰现象
限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA 存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4 个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：

实验五 DNA的限制性酶切和电泳

实验五 DNA的限制性酶切和电泳实验五dna的限制性酶切和电泳实验五dna的限制性酶切和琼脂糖电泳一、实验目的掌握dna的限制性酶切的基本原理和琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术二、实验原理1、dna的限制性酶乌限制性内切酶是基因操作中不可缺少的工具酶，它能够识别双链dna的特定位点并切开dna，这个特定位点是一段具有旋转对称结构的dna片段。

绝大多数的管制酶辨识长度为4~8个核苷酸且呈圆形二重等距的如上所述序列。

ecori的辨识序列就是g↓aattc，bmhi的辨识序列就是g↓gatcc，hindiii的辨识序列就是a↓agctt。

每种限制性内切酶都有特定的反应条件，如特定的ph范围，缓冲液组分，温育温度等，具体的使用也可参考有关的工具书或文献或产品说明。

一般温度37℃，ph7.5~8.0对大多数酶来讲是适合的，但缓冲液的组分则变化很大，典型的组分应有tris、nacl、mgcl2，和巯基试剂(如巯基乙醇或二硫苏糖醇)。

典型的反应体系中包含lμg或更太少的dna和1单位酶以及最合适的反应介质。

反应总体积通常掌控在20和50μ之间，反应时间在1小时，而反应的中止则由edta溶液的重新加入顺利完成，因为它能够鳌再分核酸酶活性所所需的金属离子。

2、dna的琼脂糖电泳dna的电泳存有琼脂糖电泳和共聚丙烯酰胺电泳，它们就是拆分、鉴别和提纯dna片段的标准方法。

dna的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。

在ph值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。

采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。

琼脂糖凝胶电泳所需样品量仅0.5~1ug。

琼脂糖凝胶对dna的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的dna。

而分离小片段dna（5~500bp）则需采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，其分辨力极高，能分离相差1bp的片段。

质粒DNA酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定

质粒DNA酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定组员：孙慜、孙苏、谢拓燕、郑倩倩、王佳玲【实验目的】1、了解DNA的限制性内切酶酶切的基本原理2、学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术【实验原理】①DNA的限制性内切酶酶切原理（1）限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA，但不能切单链DNA。

它可分为三类:I类和III类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。

III类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5‘- G↓AATTC-3‘), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3‘); 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5‘…G↓AATTC…3‘→5‘… G AATTC…3‘3‘…CTTAA↑G …5‘→3‘… CTTAA G…5‘DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。

在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。

②琼脂糖凝胶电泳条带的观察：（2）通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。

DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法

DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法一、电泳前准备准备内容作用 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净防止不必要的重复污染，减少外来的污染。

梳子干净晾干有利于梳孔的形成。

2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。

3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。

4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶实验记录备查最终越薄越好。

二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。

瓶子。

因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。

保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。

3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手制胶的桌面相对水平。

倒胶时尽量减少气泡的产生。

可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓次性倒入。

梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔度为0.5ug/ml。

不宜过低，染色成像不明显；不宜过的体积能点的下所有的样。

用枪头赶掉气泡。

高，导致背景太深。

摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。

高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。

4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。

时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。

5.拔梳子，放入电泳槽。

缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。

暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。

电泳液要浸没胶1mm。

三、上样电泳步骤注意事项 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。

质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。

TBE比TAE有相对高的缓冲能力。

（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。

（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。

②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。

③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。

④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。

（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。

pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。

而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。

这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。

可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。

但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。

实验五 DNA酶切片段的分离与回收

基因工程实验
实验注意事项
1.紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA 污染的新刀片，其目的在于防止外源 DNA的污染。
基因工程实验
作业
DNA
1. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。 2. 加入Buffer QG（每100mg凝胶加Buffer QG 300μ l），置50℃水浴10min。 3. 若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝胶加异丙醇100μ l），混匀。 4. 将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上。
实验方法
基因工程实验
5. 4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。 6. 加入500μ l Buffer QG于柱上，4℃离心 13000g×1min，弃去收集管中液体。 7. 加入750μ l Buffer PE于柱上，4℃离心 13000g×1min，弃去收集管中液体。 8. 4℃离心13000g×1min。弃去收集管。 9. 将柱放于一新1.5ml离心管上，加50μ l EB 于柱上。放置1min，4℃离心13000g×1min。
基因工程实验
DNA酶切片段的分离与回收
• • • • • 实验目的实验原理实验方法实验注意事项作业
基因工程实验
实验目的
学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片断的基本技术。
基因工程实验
实验原理
• 限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA 酶切片断。

DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳实验原理及步骤

实验6 DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳目的要求（1）掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。

（2）学习利用琼脂糖凝胶电泳方法测定DNA片段大小。

（3）学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。

原理DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。

不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电脉时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（菲啶溴红）染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。

琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅为0.5—1μg，超薄型平板琼脂糖凝胶电泳所需DNA 可低于0.5μg。

溴乙锭检测DNA，灵敏度很高，10ng（10-9g）或更少的DNA即可检出。

DNA在凝胶中的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。

将未知DNA 的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA 片段的大小。

质粒DNA分子量一般在106—107范围内，如质粒pBR322的分子量为2.8×106。

质粒DNA在细胞内存在可以有3种形式；共价闭环(ccc DNA)、线形DNA和开环的双链环状（opDNA）。

电泳时，同一质粒超螺旋DNA的泳动速度比开环和线形DNA的泳动速度为快。

提取制备的质粒DNA中，常存在超螺旋和开环DNA，在凝胶板上即可显示出2条迁移位置不同的荧光条带（见图34.1）。

本实验采用限制性内切酶Hind Ⅲ或EcoR Ⅰ酶解λDNA的片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上，连接各点绘帛出测定DNA分子量的标准曲线。

共价闭环质粒pBR322 DNA只有一个EcoR Ⅰ酶切位点，酶解后成为一条完整线状DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，测量酶解后线型DNA的迁移距离，可以直接在分子量标准曲线上得出其分子大小。

同时通过与标准pBR322 EcoR Ⅰ酶切图谱的比较分析，可以对提取质粒DNA进行鉴定。

《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验

《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验【实验目的】1、掌握实用的分子生物学基本操作技术；2、提高处理DNA样品的操作技能；3、学会使用限制性内切酶对DNA样品进行酶切；4、学会配制琼脂糖凝胶；5、学会使用电泳技术分析和鉴定DNA分子。

【实验原理】1、质粒DNA的限制性酶切DNA的酶法操作是DNA重组技术中一项最常用的工具。

特别是一系列限制性内切核酸酶的使用，能够在特异性位点切割DNA，对从分子水平上认识基因的结构与功能和进行重组DNA技术研究是非常有用的。

限制性内切酶来源于细菌，能够在特异性的目标序列中（即限制性酶切位点）切割双链DNA，从而产生特定的DNA片段（即限制性酶切片段）。

内切酶是细菌限制与修饰体系中的一员，能够使细菌细胞免受外源性DNA的侵害，即通过切割噬菌体DNA中的特异性位点来限制细菌噬菌体的繁殖，从而抑制噬菌体对细菌细胞内的入侵。

细菌通过修饰限制酶的识别位点来防止限制酶破坏其自身的DNA，通常是利用对识别位点中1个碱基的甲基化修饰来实现的。

历年来，从细菌细胞内分离纯化的限制性内切酶的种类在不断增加，并越来越多的被分子生物学家应用到DNA的体外操作中。

每种限制酶都能识别1段特异的DNA序列，其中最常见的是长度为4-6 bp的回文序列（反向重复序列）。

同时，不同种类的限制酶在识别的切割位点是不同的，有些可能是在识别位点的中间切开，产生平末端（钝末端）；而另一些限制酶可能是将识别位点错位切开，生成5’或3’突出末端（黏性末端）。

表2列举了本实验中所使用的2种限制酶的识别位点和切割位点。

表2 2种限制酶的识别位点和切割位点注：↓或↑：表示酶切位点。

2、DNA限制性内切酶酶切图谱（1）图谱简介DNA限制性内切酶酶切图谱，又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。

在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立在它的基础上。

质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分析

质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分析摘要限制性内切酶发现于某些大肠杆菌体内，能够“限制”噬菌体对其感染并帮助将已殖入的噬菌体序列移除，可以识别双链DNA上特异序列（限制性位点）并酶切。

限制酶极大地促进了分子生物学、基因工程与遗传工程领域的进展。

[1]本实验通过对大肠杆菌质粒DNA的酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，与未酶切的质粒DNA比较，分析酶切结果。

同时，本次电泳还鉴定了提取纯化的大肠杆菌基因组DNA的纯度，以及大肠杆菌HSP70基因的PCR产物。

关键词限制性内切酶；琼脂糖凝胶电泳引言自从从嗜血杆菌(Haemophilus influenza)中分离到第一种限制性内切酶---HindⅢ,[2]人们开始意识到限制性内切酶的巨大应用前景。

Daniel Nathans,Werner Arber和Hamilton O. Smith在1978年即因限制性内切酶的发现和在分子遗传学的应用被授予诺贝尔生理与医学奖。

人们将限制性内切酶应用到DNA重组技术中，在用基因重组型大肠杆菌大规模生产人胰岛素获得巨大的成功。

现在限制性酶切与PCR一样成为分子生物学中最常用的实验手段之一。

限制性内切酶被分成四种：Types I,II,III和IV。

Types I酶切位点距离识别位点较远，是具有限制性内切和甲基化修饰的多功能酶，作用时需要ATP和硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine），如EcoB,EcoK。

Types II酶切位点位于识别位点之中会较近距离，只具有限制性内切的单功能酶，作用时需要Mg2+，如EcoRI,HindIII。

Types III酶切位点距离识别位点较近，具有限制性内切活性，也被发现是修饰性甲基化酶复合物的一部分。

作用时需要ATP（但不水解ATP）和硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine）刺激反应，如EcoPI, HinfIII。

质粒DNA限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定

5. 嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA, 染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
6. 离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶), 电导率最小, DNA几乎不移动, 在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液), 则电导很高并明显产热, 严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml, 用铝箔或黑纸包裹容器, 储于室温即可。
二、材料
λDNA: 购买或自行提取纯化；
重组pUC19质粒；
EcoRI酶及其酶切缓冲液；
HindⅢ酶及其酶切缓冲液；
二、凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色, 在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外, 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带, 用于以后的克隆操作。
质粒DNA限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定
作者：未知来源：生物秀时间：2006-9-7
目的要求
（1）了解DNA的限制性内切酶酶切的基本原理。
（2）掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术。
实验原理
一、DNA的限制性内切酶酶切分析
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:I类和III类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。III类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3'); 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

生化实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳

45mmol/L Tris-硼酸，1mmol/L EDTA，pH 8.0
加样缓冲液
0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp) 0.25% xylene cyanlo FF （天蓝色，2000bp） 40%蔗糖
EB（溴化乙锭）染色液（有毒）
0.5ug /ml，用水配制
溴化乙锭(ethidium bromide，EB)
每一种限制性内切酶都有特定的反应条件 pH范围：7.5~8.0
缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷） NaCl、MgCl2、巯基乙醇
温度：37℃
琼脂糖凝胶电泳
是一种简便、快速的分离纯化和鉴定核酸的方法。
琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固,会形成良好的电泳介质。
是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。
电泳结束后，将凝胶浸入 0.5ug/ml的EB 溶液中染色10min。在紫外光照射下可见核酸电泳带，DNA量一般>5ng。
操作步骤
酶切反应
反应体系
λ－DNA 10 x Buffer Hind III H2O
电泳
在电场的作用下，在某种支持介质上，将一个混合物分离成若干条区
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0
线型DNA分离范围(Kb)
5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
试剂
TBE电泳缓冲液
Sample 1自提DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 2自提DNA酶切液20ul+4ul Loading Dye Sample 3λ-DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 4λ-DNA 酶切液20ul+4ul Loading Dye

实验五琼脂糖凝胶电泳分离DNA

2、胶板的制备
①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。
②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
③将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液（约40ml），缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面
（注意不要形成气泡）。
④待胶完全凝固后，双手轻用力取出梳子（注意勿使样品槽破裂），即可见到长方形孔格，取下橡皮膏，放在电泳槽内。
⑤加入1×TAE电泳缓冲液至电泳槽中，使胶板淹没。
3、点样
①取8μl DNA样品液与2μl 溴酚蓝染液(体积比:4/1) 混合。
②用微量移液器分别加入到凝胶板的点样孔内。每个点样孔加10μl左右。
注意：加样时，移液器枪头穿过缓冲液小心插入点样孔，但不要损坏点样孔，然后缓慢地将样品推进孔内让其集中沉于孔底部。
三、材料与试剂
➢ 1、材料：
①提取的叶片总DNA
➢ 2、试剂
① 50×TAE（50倍体积的TAE贮存液）
配100ml 50×TAE：
Tris
24.2g
冰醋酸
5.71ml
0.5mol/L EDTA 10ml（pH8.0）
用前稀释成1×TAE 。
② 凝胶加样缓冲液（6×）：
溴酚蓝 0.25%
蔗糖 40%
4、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以指示样品移动的距离。
七、作业
为什么要在制琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭？
相对分子质量不同的DNA分子，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。
3、0.6~1.4%琼脂糖凝胶适用于
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围

酶切鉴定实验报告

一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和应用；2. 学习质粒DNA的提取、纯化方法；3. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用；4. 通过酶切鉴定，验证目的基因的插入和表达。

二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme）是一种特殊的核酸酶，能够识别特定的DNA序列并在这些序列上切割双链DNA。

根据识别序列的长度和切割方式，限制性核酸内切酶分为两类：I类酶和II类酶。

其中，II类酶在分子生物学实验中应用最为广泛，如EcoRI、BamHI、HindIII等。

酶切鉴定实验的原理是：通过将目的基因与载体连接，构建重组质粒。

然后，利用限制性核酸内切酶对重组质粒进行酶切，观察酶切后的DNA片段长度，以判断目的基因是否成功插入载体。

三、实验材料1. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA分子量标准等；2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、紫外分光光度计等；3. 样品：重组质粒、载体DNA、目的基因DNA等。

四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化（1）取含有重组质粒的细菌，用碱裂解法提取质粒DNA；（2）将提取的质粒DNA进行酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，得到纯化的质粒DNA。

2. 重组质粒的构建（1）取目的基因DNA和载体DNA，分别进行PCR扩增；（2）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的基因和载体DNA的大小；（3）利用DNA连接酶和T4 DNA连接酶，将目的基因连接到载体上；（4）转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。

3. 酶切鉴定（1）取重组质粒和载体DNA，分别进行酶切反应；（2）将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的DNA片段长度；（3）根据酶切结果，判断目的基因是否成功插入载体。

4. 结果分析根据琼脂糖凝胶电泳结果，比较重组质粒和载体DNA的酶切产物。

若重组质粒在目的基因插入位点附近出现新的酶切位点，则说明目的基因成功插入载体。

DNA的限制性酶切及电泳分析

DNA的限制性酶切及电泳分析DNA的限制性酶切及电泳分析实验目的：1．掌握限制性核酸内切酶消化DNA的原理。

2．掌握重组质粒DNA的酶切鉴定方法。

3．掌握琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。

基本原理限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶（水解磷酸二酯键）。

根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。

主要试剂:重组质粒DNA 插入片段300bp本实验所用限制性核酸内切酶为EcoRⅠ，其识别顺序为：5′----G↓AATT C----3′3′----C TTAA↑G----5′磷酸二脂键断裂产生5′粘性末端。

操作步骤1. 反应体系的建立：⑴在一无菌1.5 ml Eppendorf管中加入：无菌双蒸水7 μl10×酶切缓冲液2 μl质粒DNA(100 ng/μl) 10 μlEcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl总体积为20μl⑵轻轻混匀，12000 rpm离心5 sec。

2. 37 ℃水浴1 h。

3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失活以终止反应。

4. 12000 rpm离心5 sec，将管盖及管壁上的水离下。

5. 取10 μl消化产物，与2 μl 6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100 V 30～60 min。

6 结果观察。

操作注意事项：1. 吸样量一定要准确2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶3. 要求在冰上操作，并充分混匀，4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。

5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。

限制性内切酶酶解中常见的问题和原因1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。

DNA的限制性酶切实验原理

分别加入DNA 5μl， 10×缓冲液2μl,BSA 2ul，EcoRI 1ul， ddH2O 10ul，用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
（2）、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应，反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则是酶：ＤＮＡ=２－３：１２小时即可，充分酶解。
学习课程项目教学管理心理学生
物计算机多媒体课件
23
Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；
NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：
低盐（10mM NaCl)
中盐（50mM NaCl）
高盐（100mM NaCl）
不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
学习课程项目教学管理心理学生
物计算机多媒体课件
22
五、注意事项——限制性内切酶酶切
五、注意事项——DNA凝胶电泳
• 1. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
• 2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能

DNA酶切及凝胶电泳实验原理、仪器试剂和操作步骤

DNA酶切及凝胶电泳实验原理、仪器试剂和操作步骤【实验原理】DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。

由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。

具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。

DNA 分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系.。

凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。

如上次实验提取的pUC19 质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA (covalently closed circular DNA，简称CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，（open circular DNA, 简称OCDNA）,线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA2 条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。

这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。

因此电泳后呈3 条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，开环质粒DNA。

【实验材料】λDNA: 购买或自行提取纯化; 重组pBS 质料或pUC19 质粒; EcoRI 酶及其酶切缓冲液: 购买成品; HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。

【实验仪器】水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件。

【实验试剂】1、5×TBE电泳缓冲液：配方见实验一。

2、6×电泳载样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。