MTT

ODtreatment:干预组，治疗组(Treatment Group)又称加药组，指经过实验处理的被试组。ODtreatment是指加药组的吸光值。
ODM：空白组，只加培养基，用来使机器吸光值调0的被试组。
(避光)每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。(通常加入DMSO后在台子上铺张卫生纸十字振荡几次等一会儿拿到楼下的酶联免疫检测仪处在检测前机器会自动低速振荡2min)
4.
选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光值OD，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。
4.吹打次数100次左右，就可以吹打均匀了。铺板时，每接种一排复孔后反复吹打3~4次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。
5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后在台子上铺张纸，将板向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些
3.
培养16~48h后，(避光)每孔加入MTT溶液20ul(5mg/ml，用ph4.7的PBS配)，继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。(若药物与MTT能够反应，则先弃去培养液，用PBS冲2~3遍后，再加入含MTT的培养液)
终止培养，小心吸去孔内培养液。
实验步骤
1.
用含10%的胎小牛血清的培养基配成单个细胞悬液，以每孔103-104个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul，用无菌的PBS填充边缘孔。
注意：
1.选择适当的细胞接种浓度，细胞数太多敏感性降低，细胞数太少观察不到差异。细胞接种密度不能过大，一般每孔1000个左右，所以96孔≈100孔，100ul每孔，100ul*100=10ml细胞悬液，细胞浓度为104个/ml。
2.
置于37。C，5%CO2的培养箱中孵育，直至细胞生长呈单层，铺满96孔培养板，加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，通常前一天下午铺板，次日上午加药。一般5~7个梯度，每孔3~4个复孔，每孔100ul。培养16~48h(可根据实验目的和要求决定培养时间)。
注意：
根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时
通过琥珀酸脱氢酶活性进
实验目的
用MTT法测定细胞相对数和相对活力的原理和方法
实验原理
活细胞的线粒体中含有琥珀酸脱氢酶，能是外源性的MTT(噻唑蓝)还原为不溶性的甲臜(formazan)，呈蓝紫色结晶，沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可用作活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在50%的N,N-二甲基甲酰胺(DMF,有毒)和20%、pH4.7的十二烷基磺酸钠(SDS)的MTT溶解液中溶解，通常我们用DMSO(二甲基亚砜，避光保存)来溶解。用酶标仪测定490nm处吸光值(OD)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测试药物毒性,则表示药物毒性越小)。MTT主要可用作药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定和细胞增殖及细胞活性测定。
注意事项
(1)选择适当的细胞接种浓度，接种细胞的数量要准确。
(2)避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
(3)设置凋零孔、对照孔及加药孔，其中细胞、培养基、MTT、DMSO，即对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
(4)MTT实验吸光值最后要在0~0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。
(5)配成的MTT需要无菌，现用现配，过滤后避光4。C保存2周内有效，也可配制成5mg/ml保存在-20。C长期保存，最好小剂量分装，用锡箔纸包住避光以免分解，避免反复冻融。
关于如何计算
IC50是半抑制剂，意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50%抑制率时候的药品浓度，就是IC50。
寇式改良法:
Xm:lg最大剂量I:lg(最大剂量/相邻剂量) P:阳性反应率之和
Pm:最大阳性反应率(即最大抑制率) Pn:最小阳性反应率(即最小抑制率)
抑制率计算公式:
存活率计算公式:
存活率=1-抑制率
ODcontrol:控制组(Control Group)又称对照组，指不接受实验处理的被试组。
ODcontrol是指对照组的吸光值。
细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接一排复孔就再混匀一下。
2.吹打细胞时，细胞悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀。10ml的离心管中最好装3~4ml的悬液，悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多不容易吹成单细胞悬液。
3.吸管的吸液量最好在1ml左右，吸液量过多的话，一下吸气很多液体，管中所剩的就少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打力度就不够，吹打就不会均匀。