板栗过氧化氢酶基因CmCAT的克隆与原核表达

收稿日期:2018-07-04基金项目:国家自然科学基金（31400547）。

作者简介:刘裕峰，博士研究生。

*责任作者：韩珊，副教授，研究方向为林木病理与分子生物学，E-mail ：hanshan6618@ 。

板栗过氧化氢酶基因CmCAT 的克隆与原核表达刘裕峰，朱天辉，刘应高，谯天敏，李姝江，龙旭梅，韩珊*（四川农业大学林学院，成都611130）摘要:【目的】旨在克隆板栗CmCAT 基因全长cDNA 序列，分析其编码蛋白相关信息并进行原核表达研究。

【方法】采用RT-PCR 技术从板栗品种“石丰”中克隆获得CmCAT 基因，用生物信息学方法对获得的cDNA 序列及推定的氨基酸序列进行分析。

构建原核表达载体pET28a-CmCAT ，经PCR 和酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。

【结果】板栗CmCAT 基因开放阅读框（ORF ）为1479bp ，共编码492个氨基酸，推测蛋白分子质量为56.883kDa ，理论等电点pI 为5.83，GenBank 登录号为KY312851。

其核苷酸序列与核桃（Juglans regia ）CAT 基因序列相似性最高，为85%。

遗传进化分析表明，板栗CmCAT 与核桃的亲缘关系最近。

SDS-PAGE 电泳分析表明，在30℃条件下，0.2mmol/L IPTG 诱导6h 表达量最佳，诱导的目的蛋白分子量约为60kDa ，其主要以包涵体的形式存在。

【结论】成功克隆了板栗CmCAT 基因，并对其编码蛋白的理化性质进行了预测分析，在大肠杆菌中获得了大量的表达，为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。

关键词:板栗；过氧化氢酶；基因克隆；原核表达中图分类号:S763曰Q786文献标志码:Ａ文章编号:1000-2650（2019）02-0168-09Cloning and Prokaryotic Expression of Catalase Gene CmCAT fromCastanea mollissima BLLIU Yufeng ，ZHU Tianhui ，LIU Yinggao ，QIAO Tianmin ，LI Shujiang ，LONG Xumei ，HAN Shan *（College of Forestry ，Sichuan Agricultural University ，Chengdu 611130，China ）Abstract:【Objective 】The aim to clone the full-length cDNA of CmCAT gene from Castanea mollissima ，and to analyze its protein-related information and to study its prokaryotic expression.【Method 】The CmCAT gene was cloned from Castanea mollissima ‘Shifeng ’by RT-PCR ，and the obtained cDNA se -quence and the deduced amino acid sequence were analyzed by bioinformatics method.The prokaryotic expression vector pET28a-CmCAT was constructed and then transferred into E.coli BL21(DE3)by PCR and restriction enzyme digestion.【Result 】The open reading frame (ORF)of CmCAT gene was 1479bpand encoded 492amino acids.The molecular weight of the protein was 56.883kDa ，the theoretical iso -electric point (pI)was 5.83，and the GenBank accession number was KY312851.The CmCAT nucleotide sequence shared the highest homology (85%)with that in Juglans regia .Genetic evolution analysis showed that CmCAT had the closest genetic relationship with Juglans regia .SDS-PAGE analysis showed that the optimal expression conditions of gene were 6h under 30℃by 0.2mmol/L IPTG inducing.The molecular weight of the target protein was about 60kDa ，which was mainly in the form of inclusion body.【Conclusion 】The CmCA T gene from Castanea mollissima was successfully cloned ，and its physicochem -ical properties were predicted and analyzed.CmCAT protein was expressed in BL21(DE3)largely.Which laid the foundation for further biological function research.Keywords ：Castanea mollissima BL ；catalase (CAT)；gene cloning ；prokaryotic expression第37卷第2期2019年4月Vol.37No.2Apr .2019四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural University首次发现动植物组织能够分解过氧化氢产生氧气可追溯到1811年，后被发现可能是某种酶起作用，直到1901年，该酶被命名为过氧化氢酶（hudrogen peroxidase），又名触酶（catalase，CAT）[1]。

现已发现在动物、植物及微生物体内均含有大量的CAT。

病原菌的入侵会打破超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（·OH）等活性氧类（reactive oxygen species，ROS）物质的动态平衡，导致活性氧物质在植物体内大量积累，长时间的积累而得不到有效的清除，会损伤植物细胞膜系统，破坏蛋白质功能，严重时导致植株死亡[2]。

CAT作为植物体内主要的抗氧化酶之一，它能够催化植物光呼吸、线粒体电子传递及脂肪酸氧化等过程中产生的H2O2生成O2和H2O[3]。

有报道称[4]，一分子CAT每分钟能将大约6×106个H2O2分子转化成H2O和O2。

因此，CAT对H2O2的清除具有较高的特异性，并且在去除H2O2过量中起关键作用[5]，使得植物不受伤害。

大量研究表明，CAT与植物的抗病性存在着紧密的联系。

Pei Z.M.等[6]研究发现，缺失CAT基因的烟草体内H2O2含量增加，导致细胞死亡；Jiang M.等[7]发现，植物的CAT活性能够被水杨酸抗病因子抑制，导致过多的ROS产生，进而引起植物系统性的防御反应；病原菌浸染植物的初期阶段，CAT催化H2O2生成O2，触发苯甲酸生成水杨酸，导致系统性防卫反应的发生[8]；转玉米CAT2基因的烟草遭受病原菌侵染后，诱发严重的超敏反应，进而有效地控制细菌的进一步感染[9]；转基因烟草植株体内酵母CAT1基因的过量表达，能够提高转基因植株的抗病毒侵染能力[10]。

植物CAT基因家族由多个基因编码，其表达受病原、温度、光照、干旱等多种因子的调控[11]。

目前，已从火龙果[12]、人参[13]、甘薯[14]、南瓜[15]、水稻[16]、坛紫菜[17]等多种植物中克隆获得CAT基因并进行相关分析。

但目前关于板栗CAT基因的相关研究较少，异源表达方面的研究尚属空白。

本研究在板栗转录组学研究[18]的基础上，利用RT-PCR技术克隆获得板栗CAT基因全长cDNA序列，并进行了相关生物信息学分析，同时构建pET28a-CmCAT原核表达载体，在大肠杆菌中进行了融合表达，旨在了解其基因结构和功能，为进一步研究板栗抗病的分子机理奠定基础。

1材料和方法1.1试验材料供试板栗品种为“石丰”，种植于四川农业大学林学院崇州基地；植物RNA提取试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司；PCR反转录试剂盒、pMD19-T载体购自大连TaKaRa公司；DNA纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；表达载体pET-28a由四川农业大学林学院林木病理学实验室提供；大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶EcoR I、Xho I、T4DNA连接酶购自NEB （北京）有限公司；其他试剂为进口或国产分析纯。

1.2总RNA的提取与cDNA的合成以板栗幼叶作为RNA提取材料，使用植物多糖多酚RNA提取试剂盒（北京华越洋生物）提取总RNA。

提取的总RNA经BioMate3S（BioMate3S，Thermo Scientific）及1%的琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和完整性。

cDNA第一链的合成使用PrimeScript TM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（TaKaRa，大连），具体操作步骤参照说明书进行。

合成的cDNA 保存于-80℃，用于后续试验。

1.3CmCAT基因的克隆根据NCBI数据库中已公布的其他植物CAT 基因核苷酸序列，将其与板栗基因组数据库（http：// /）进行同源比对，寻找并分析板栗CAT基因EST序列，使用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性引物CmCAT-F：5'-ATG GATCCCTACAAGTACCG-3'，CmCAT-R：5'-TCA CATTGTTGGCCTCAC-3'。

以反转录的板栗cDNA 为模板，进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸7min。